肺癌细胞RhoA、RhoB和RhoC的表达及意义

狄松波 刘立荣 曹奇峰 莫 巍 王丹萍 浙江省台州市中西医结合医院 台州 317523

肺癌细胞RhoA、RhoB和RhoC的表达及意义

狄松波 刘立荣 曹奇峰 莫 巍 王丹萍 浙江省台州市中西医结合医院 台州 317523

目的通过研究RhoA、RhoB和RhoC在肺癌组织及细胞系中表达水平的变化，探讨Rho亚家族与肺癌发生、发展及转移的关系。方法应用荧光定量RT-PCR法、Western blotting法研究四种肺癌细胞系RhoA、RhoB和RhoC mRNA和蛋白表达水平变化，免疫组织化学法检测45例人肺癌组织RhoA、RhoB和RhoC蛋白表达。结果四种肺癌细胞系RhoA和RhoB mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组（P均＜0.05），肺癌细胞系组间比较，表达水平差异无统计学意义（P均＞0.05），各组间RhoC mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义（P均＞0.05）。RhoA、RhoB蛋白在人肺癌组织呈阳性表达，中分化鳞癌组阳性率与非中分化鳞癌组阳性率差异无统计学意义（P均＞0.05），而RhoC全部呈阴性表达。结论RhoA、RhoB在肺癌组织中异常高表达，提示Rho亚家族参与了肺癌的发生、分化和转移过程。

肺癌；RhoA；RhoB；RhoC

肺癌已成为目前人类因癌症死亡的主要原因，其发病率将呈上升趋势[1]。而且大多数患者确诊时已属晚期，通常已发生转移，严重影响患者的生存质量。肺癌的发病及转移机制十分复杂，至今尚未完全阐明，目前认为它与吸烟、环境污染等相关，涉及多种分子机制[2]。因此，揭示肺癌发病及转移机制，对判断预后和延长患者的生存质量等具有重要的意义。研究表明，Rho（Ras homologue）家族参与了肿瘤的恶性转型、生长、侵袭、转移以及肿瘤的血管生成等多个方面。但它与肺癌关系的研究目前报道较少，其在肺癌的发生和转移中的作用机制目前尚不清楚。本研究通过观察肺癌组织及细胞系中Rho亚家族3个重要分子RhoA、RhoB、RhoC mRNA和蛋白水平的变化，探讨Rho亚家族在肺癌发生、转移及病理过程中的作用，为肺癌发病机制的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1一般资料 肺癌组织标本收集于2001年—2009年间浙江省温岭市中医院住院手术患者45例，其中中分化鳞癌21例，中低分化腺癌1例，大细胞神经内分泌癌3例，中低分化混合型腺癌7例，低分化鳞癌11例，混合型腺癌1例，腺鳞癌1例；根据病理分化程度分为中分化鳞癌组21例和非中分化鳞癌组24例（除中分化鳞癌外的其它肺癌）。

1.2肺癌细胞系 所用5种细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院，分别为人肺腺癌细胞LTEP-a-2、人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人小细胞肺癌细胞NCI-H446、淋巴结转移的人肺癌细胞NCI-H292以及人胚肺细胞MRC-5（对照组）。

1.3荧光定量PCR法检测肺癌细胞系RhoA、RhoB及RhoC mRNA表达 细胞接种于无菌含有10%胎牛血清的DMEM培养液的六孔板中，细胞浓度约106，采用Trizol RNA抽提试剂从5种培养细胞系中提取总RNA，RNA的浓度和纯度由260nm处吸光度值以及260nm和280nm处吸光度比值决定，再从总RNA中分离纯化mRNA。

采用TaKaRa公司的定量RT-PCR试剂盒进行基因表达定量，逆转录的反应体系包括1μg的RNA、5mmol/L的MgCl2、1×RNA PCR缓冲液、1mmol/ L的dNTP、1U/μL的RNA酶抑制剂、0.25U/μL的反转录酶、0.125μmol/L寡dT引物和8.5μL的无RNA酶去离子水，总体系20μL。逆转录反应在42℃进行30min后，于99℃灭活10min并冷却至4℃。逆转录完成后进行PCR扩增的体系共80μL，包括2μL的cDNA模板、2.5mmol/L的MgCl2、1×RNA PCR缓冲液、0.2μmol/L的Rho基因特异引物、0.2μmol/L的对照基因β2微球蛋白基因特异引物、2.5U/100μL的Taq酶。PCR扩增引物序列见表1。PCR反应条件为：共32个循环，每个循环94℃变性30s、58℃退火1min、72℃延伸1min。每种细胞系分别做3次平行实验，取其平均值为代表值。利用Opticon Monitor软件将平均Ct值转化为表达量值，把正常人胚肺细胞MRC-5相对表达量值定为1，其余细胞和其比较后计算出相对表达量值（用2-△△CT表达）。

1.4Western blot法检测肺癌细胞系RhoA、RhoB及RhoC蛋白表达 取收集细胞浓度约106，加入RIPA充分裂解细胞，经BCA法进行蛋白定量后，取80μg蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，常规转膜。室温下5%脱脂奶粉封闭1h，分别加入稀释的单克隆抗体，其中RhoA抗体按1：2000稀释（购自abcam公司），抗体RhoB、RhoC均按1：1000稀释（均购自santa cruz公司），4℃过夜，经TBST充分洗涤后再与抗鼠IgG-AP室温孵育2h，TBST充分洗涤后，采用AP化学发光试剂盒显色。β-actin蛋白作为阳性对照。每种细胞系分别做3次平行实验，将各样本吸光度值用各自内参照β-actin值进行校正，比较获得比值的差异，取其平均值为代表值。

1.5免疫组化法检测人肺癌组织RhoA、RhoB及RhoC蛋白表达 免疫组化实验按照两步法操作。先将切片置60℃烤箱烘烤2h脱蜡至水，蒸馏水中清洗2min，高压热修复抗原，3%H2O2溶液阻断过氧化物酶10min，滴加一抗（抗体RhoA、RhoB稀释倍数为1：300，RhoC稀释倍数为1：50）37℃孵育1h，滴加二抗37℃孵育1h，DAB显色，复染、透明后封片。

采用双人盲法观察免疫组化蛋白表达结果，判定标准为：细胞不着色为阴性细胞（-），细胞有极少量着色为弱阳性（+-），视野内个别细胞呈棕黄色为阳性（+），视野内多个细胞呈棕黄色为中等阳性（++），视野内多数细胞呈棕黄色、部分细胞呈棕褐色为强阳性（+++）。阳性率为阳性（+）及以上的例数与总例数的比值。

1.6统计学方法 应用SPSS16.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（） 表示，样本均数比较采用单因素方差分析，levene法检验方差齐性。多组间两两比较方差齐时应用LSD-t检验，方差不齐时应用Dunnett T2检验，率的比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1肺癌细胞系RhoA、RhoB及RhoC mRNA相对表达量 荧光定量PCR结果显示，RhoA、RhoB mRNA在四种肺癌细胞系中的相对表达量显著高于正常胚肺细胞MRC-5（P均＜0.05），而四种肺癌细胞系间两两组间比较，相对表达量差异无统计学意义（P均＞0.05）；RhoC mRNA相对表达量在肺癌细胞系之间及与正常人胚肺细胞MRC-5差异无统计学意义（P均＞0.05），见表2。

表2 5种细胞系RhoA、RhoB及RhoC mRNA相对表达量比较（）

注：与MRC-5细胞系组比较，*P＜0.05

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2.2肺癌细胞系RhoA、RhoB及RhoC蛋白表达

Western blot结果显示，RhoA、RhoB蛋白在四种肺癌细胞系中均呈强阳性表达，在四种肺癌细胞系的表达量显著高于正常人胚肺细胞MRC-5（P均＜0.05），不同肺癌细胞系之间的表达量差异无统计学意义（P均＞0.05）。RhoC蛋白表达量在肺癌细胞系之间及与正常人胚肺细胞MRC-5差异无统计学意义（P均＞0.05），见表3、图1（插页）。

表3 5种细胞系RhoA、RhoB及RhoC mRNAR相对表达量比较（）

表3 5种细胞系RhoA、RhoB及RhoC mRNAR相对表达量比较（）

注：与MRC-5细胞系组比较，*P＜0.05

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2.3人肺癌组织RhoA、RhoB及RhoC蛋白表达

免疫组化结果显示，RhoA、RhoB蛋白在人肺癌组织中呈阳性表达，RhoA的阳性率为97.8%（44/45）、RhoB的阳性率为100%，而RhoC全部为阴性。RhoA、RhoB蛋白阳性率在中分化鳞癌组与非中分化鳞癌组差异无统计学意义（P均＞0.05）,见表4、图2～4（插页）。

3 讨论

肿瘤的生长和转移是一个复杂的多步骤过程，受多种因素影响。近年研究表明，Ras信号通路通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡参与了癌细胞的发生与发展[3]。Rho亚家族属于Ras超家族小分子量G蛋白的成员，在细胞分裂和增殖中起着重要的生物学作用，通过其下游效应器ROCK（Rho associated kinase）与恶性肿瘤发生、发展、侵袭转移相关，是很有前景的肿瘤治疗靶点。在小细胞肺癌组织中研究发现，RhoGDI蛋白的表达水平显著高于非小细胞肺癌，中、低分化非小细胞肺癌组织显著高于中、高分化[4]。

表4 肺癌组织RhoA、RhoB、RhoC蛋白阳性率（）

表4 肺癌组织RhoA、RhoB、RhoC蛋白阳性率（）

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RhoA、RhoB和RhoC是Rho家族中主要的3种亚型，目前发现它们与多种癌症的发生有关。在一项胃癌的研究发现，RhoA在胃癌细胞的增殖、凋亡、黏附中起着重要的作用，抑制其功能可以促进胃癌细胞的凋亡[5]。RhoB蛋白是Rho家族中一个较为独特的分子，其在细胞内定位、调控等功能方面都与RhoA蛋白存在很大不同。有研究表明，RhoB在多种肿瘤组织中的表达低下或缺失，它与RhoA存在一个相互拮抗的作用[6]。

本研究发现四种肺癌细胞系中RhoA、RhoB mRNA和蛋白表达水平高于正常胚肺细胞系MRC-5（P＜0.05），且人肺癌组织免疫组化结果示它们大部分呈阳性表达，提示RhoA、RhoB参与了肺癌的形成过程。在淋巴结转移的肺癌细胞系NCI-H292中它们的表达增强，提示RhoA、RhoB与肺癌的转移有关。本研究还发现，对于四种不同病理特征的肺癌细胞系，RhoA和RhoB的表达量无明显差异，免疫组化结果也表明这两种蛋白表达在不同病理特征的人肺癌组织中无明显差异，提示RhoA和RhoB可能与肺癌的病理分型无关。

RhoC主要通过促进基质降解、细胞迁移、血管生成等一系列途径促进肿瘤细胞侵袭转移。本研究发现四种肺癌细胞系RhoC mRNA和蛋白表达水平与人胚肺细胞MRC-5差异无统计学意义（P＞0.05），而且人肺癌组织免疫组化结果其表达全部为阴性。而相似的研究却发现，RhoC在非小细胞肺癌中高表达，且与淋巴结转移、肿瘤临床分期显著相关，机制可能为RhoC的高表达活化了相关的下游蛋白[7]。在人肺巨细胞癌细胞系BE1（高转移能力亚型）、LH7（低转移能力亚型）、人肺腺癌细胞系A549、A2肺癌细胞系中发现RhoC蛋白和mRNA的表达升高，高转移能力亚型高于低转移能力亚型[8]。我们推测本研究结果与其他学者研究不一致的原因是RhoC的表达可能与肺癌细胞分型不同有关，其机制有待于进一步研究。

综上所述，Rho家族RhoA和RhoB在肺癌细胞系及临床肺癌组织中表达升高，提示它们与肺癌细胞的形成和转移密切相关，可能被作为肺癌发展的生物标记物之一；而RhoC的表达可能随肺癌细胞分型不同而不同。

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Expression of RhoA,RhoB and RhoC in Lung Cancer Tissues and Their Clinical Significance

DI Songbo，LIU Lirong，CAO Qifeng，MO Wei，WANG Danping.Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Taizhou，Taizhou(317523),China

ObjectiveTo investigate changes of expressions of RhoA and RhoB and RhoC in lung cancer tissues to explore the relationship of Rho subfamily with development，migration，and metastasis of lung carcinoma.MethodsThe expressions of RhoA，RhoB and RhoC mRNA and protein in four different lung cancer cell lines（LTEP-a-2，SK-MES-1，NCI-H446，and NCI-H292）were detected by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（QRT-PCR）and Western blotting,and were compared with MRC-5（control group）.The expressions of RhoA，RhoB and RhoC protein in 45 cases of lung cancer tissue by immunocytochemistry.ResultsThe expressions of RhoA and RhoB mRNA and protein in lung cancer cell line LTEP-a-2，SK-MES-1，NCIH446，and NCI-H292 were significantly higher than those in control group（all P＜0.05），while no statistical difference was found among four lung cancer cell lines（all P＞0.05）.The expressions of RhoA and RhoB protein in human lung cancer tissue were positive，but the levels of them were not statistically different between moderately differentiated squamous carcinoma group and non-moderately differentiated squamous carcinoma group（all P＞0.05）. The expression of RhoC protein was negative.ConclusionThe expressions of RhoA and RhoB were elevated in lung cancer，which indicates that Rho subfamily involve in the development，migration and metastasis of lung cancer.

lung cancer；RhoA；RhoB；RhoC

2014-03-18

修回日期：2014-05-05

浙江省医药卫生科学研究基金资助项目（No.2007A196）

狄松波，E-mail：disongbo1970@163.com