TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义

刘慧敏俸艳英 高彩云阳志军

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科；△广西医科大学研究生学院

临床研究

TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义

刘慧敏△俸艳英 高彩云△阳志军

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科；△广西医科大学研究生学院

目的 探讨跨膜四超家族成员1（transmembrane 4 super family 1，TM4SF1）蛋白在人卵巢组织中的表达及其与上皮性卵巢癌临床病理因素的关系。方法 采用免疫组化SP法检测16例正常卵巢上皮组织、23例上皮性卵巢良性肿瘤组织及55例上皮性卵巢癌癌组织中TM4SF1蛋白的表达情况，分析其与上皮性卵巢癌临床病理因素及预后的关系。结果 ①TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌癌组织中的阳性表达率（90.90%）高于上皮性卵巢良性肿瘤组织（65.22%）及正常卵巢上皮组织（25.00%）的阳性表达率，差异有统计学意义（P<0.05）。②TM4SF1蛋白在正常卵巢上皮细胞中的表达主要位于上皮细胞的细胞膜和细胞膜近基底膜处及细胞质中，在卵巢良性肿瘤组织中的表达主要集中在肿瘤细胞的细胞膜近基底膜处及细胞膜其他部位，而在卵巢癌细胞中则主要分布于癌细胞的细胞质中。③Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者TM4SF1蛋白的阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，中低分化癌患者TM4SF1蛋白的阳性表达率高于高分化癌患者（P<0.05）。④TM4SF1蛋白的阳性表达率与组织学类型、腹水量的多少无明显相关（P>0.05），而与FIGO分期及组织学分级明显相关（P<0.05）。⑤Cox比例风险回归模型多因素分析显示TM4SF1蛋白在卵巢癌癌组织中的阳性表达不是影响患者生存的独立预后因素。结论 TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌癌组织中呈高表达，可能与卵巢癌的发生、发展相关。

卵巢肿瘤；TM4SF1；上皮性卵巢癌；免疫组织化学

卵巢癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤，其死亡率在女性生殖系统恶性肿瘤中居首位，虽然手术治疗和细胞毒性药物化疗取得了很大进步，但卵巢癌发生、发展可能涉及的分子作用机制仍不明确。本课题组前期研究从上皮性卵巢癌患者腹水癌细胞构建的cDNA表达文库中筛选出相关抗原跨膜四超家族成员1（transmenbrane 4 super family l，TM4SF1），并发现血清中TM4SF1的自身抗体可作为卵巢癌诊断的血清标志物［1］。但TM4SF1蛋白在人卵巢组织中的表达情况及其在上皮性卵巢癌发生、发展中的作用尚不清楚。本研究采用免疫组化SP法检测不同类型卵巢组织中TM4SF1蛋白的表达情况，并分析其表达与临床病理特征及其与上皮性卵巢癌患者预后的关系，以探讨TM4SF1蛋白的表达在上皮性卵巢癌发生、发展中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本来源 组织蜡块均来自广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科2008年7月至2012年7月手术切除的组织标本，均经病理科专家再次确诊。原发性上皮性卵巢癌患者55例，年龄21~74岁，中位年龄47岁。其中浆液性癌29例，黏液性癌16例，子宫内膜样癌8例，透明细胞癌2例。按FIGO（2004）分期标准，其中Ⅰ~Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期34例。对所有上皮性卵巢癌患者进行随访，中位随访时间为33个月（1～60个月），均无非癌死亡及失访病例。卵巢良性肿瘤患者23例，年龄23~59岁，中位年龄43岁，其中浆液性瘤13例，黏液性瘤10例。正常卵巢上皮组织患者11例，均来自因子宫肌瘤或多囊卵巢而行卵巢全部或楔形切除的患者，年龄28~66岁，中位年龄46岁。

1.1.2 主要试剂 一抗兔抗人肿瘤相关抗原L6多克隆抗体（bs-6242R）购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组化SP超敏试剂盒、DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

采用免疫组化SP法，石蜡切片经脱蜡水化后，用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液高压法修复抗原20 min，羊血清封闭15 min，一抗按1∶200稀释后4℃孵育过夜，羊抗兔二抗37℃孵育1 h，DAB显色1min，风干后封片。阳性对照选用乳腺癌组织，阴性对照以PBS代替一抗。

1.3 结果判断

在细胞膜或细胞质中出现黄色颗粒者判断为TM4SF1蛋白染色阳性。随机选取5处无坏死区域的卵巢组织部位，镜下（×400）对每个视野观察100个细胞，根据染色强度和阳性细胞数综合判断该视野得分，分别记录后取平均分为该切片免疫组化染色得分。染色强度计分标准：无色（-）为0分，浅黄色（+）为1分，棕黄色（++）为2分，棕褐色（+++）为3分。阳性细胞数计分标准：≤5%为0分，6%~25%为1分，26% ~50%为2分，51%~75%为3分，>75%为4分。二项计分之积>3者定为TM4SF1蛋白阳性表达。所有切片均由两位观察者独立阅片、计分后取平均值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件处理分析数据。计数资料的比较采用χ2检验和Fisher′s确切概率法。多因素分析采用Cox比例风险回归模型分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TM4SF1蛋白在卵巢组织中的表达情况

TM4SF1蛋白在不同类型卵巢组织中均有表达（图1、表1），在上皮性卵巢癌癌组织中的阳性表达率（90.90%）高于卵巢良性肿瘤组织（65.22%）及正常卵巢上皮组织的阳性表达率（25.00%），在卵巢良性肿瘤组织中的阳性表达率（65.22%）亦高于正常卵巢上皮组织的阳性表达率（25.00%），差异均有统计学意义（P均<0.05）。

2.2 TM4SF1蛋白在不同类型卵巢细胞中的定位情况

TM4SF1蛋白在正常卵巢上皮细胞中的表达主要位于上皮细胞的细胞膜（图1中C1的黑色箭头所示）和细胞膜近基底膜处及细胞质中；在卵巢良性肿瘤细胞中的表达主要集中在肿瘤细胞的细胞膜近基底膜处（图1中E1的黑色箭头所示）及细胞膜其他部位，而在卵巢癌细胞中则主要分布于癌细胞的细胞质中（图1中F1的红色箭头所示）。

表1 TM4SF1蛋白在卵巢组织中的阳性表达情况［n（%）］

图1 免疫组化SP法检测TM4SF1蛋白在上皮性卵巢组织中的表达（SP×400）

2.3 TM4SF1蛋白的阳性表达与上皮性卵巢癌临床病理因素的关系

FIGO分期中Ⅲ～Ⅳ期患者TM4SF1蛋白的阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期者（P<0.05），中低分化癌患者TM4SF1蛋白的阳性表达率高于高分化者（P<0.05）。TM4SF1蛋白的阳性表达与组织学类型和腹水量的多少无明显相关（P>0.05），而与FIGO分期及组织学分级明显相关（P<0.05）。见表2。

2.4 上皮性卵巢癌组织中TM4SF1蛋白的阳性表达与预后的关系

将TM4SF1蛋白的表达情况及可能影响预后的相关因素如年龄、FIGO分期、组织学分级、腹水量等，经Cox比例风险回归模型先行单因素分析，将其中有意义的因素再进行多因素分析。结果显示TM4SF1蛋白的阳性表达和腹水量的多少不是影响上皮性卵巢癌患者预后的独立因素（P>0.05），而FIGO分期及组织学分级是影响上皮性卵巢癌患者预后的因素（P<0.05）。见表3。

表2 上皮性卵巢癌患者TM4SF1蛋白的阳性表达与临床病理因素的关系［n（%）］

表3 影响上皮性卵巢癌患者预后的单因素分析及多因素分析

3 讨论

TM4SF1也称肿瘤相关抗原L6（tumor-associated antigen L6，TAAL6），是TM4SF家族的一个远亲，在不同的癌组织中呈高表达，而在许多正常组织中低表达或不表达。对TM4SF家族成员的保守结构域进行分析［2］，发现TM4SF1属于一个含有TM4SF4/IL-TMP、TM4SF5/L6H、TM4SF18/L6D、TM4SF19/OCTM4及TM4SF20/TCCE518在内的新的超家族。目前虽然对TM4SF1的确切功能和生理作用还不明确，但Gordon等［3］认为TM4SF1是恶性胸膜间皮瘤细胞凋亡的负性调控基因，可促进肿瘤细胞的生长。增加TM4S1蛋白的表达可以增强肺癌细胞的侵袭能力，抗TM4SF1的单克隆抗体可明显降低肺癌细胞的侵袭能力［4］。敲除TM4SF1基因可降低前列腺癌细胞的迁移及宫颈癌细胞的转移能力［5］。越来越多的研究表明，TM4SF1对癌细胞的生长、迁移、侵袭和转移有重要意义。研究显示实体恶性肿瘤的生长依赖于新生肿瘤血管的形成。Shih等［6］发现，TM4SF1蛋白在多种肿瘤的血管内皮细胞（endothelial cell，EC）中呈高表达，并与EC的伪足形成密切相关，敲除TM4SF1基因可阻止EC的伪足形成、抑制细胞迁移、阻滞细胞质分裂、促进EC衰老，可大量抑制血管内皮生长因子-A（VEGF-A）诱导的微血管形成。因此TM4SF1可能与多种肿瘤的发生、发展密切相关。本研究结果显示，TM4SF1蛋白在卵巢良性肿瘤组织中的阳性表达率高于正常卵巢上皮组织的阳性表达率，在上皮性卵巢癌癌组织中的阳性表达率高于卵巢良性肿瘤组织和正常卵巢上皮组织的阳性表达率；同时，随着上皮性卵巢癌FIGO分期的升高、分化程度的降低，TM4SF1蛋白的阳性表达率亦升高，提示TM4SF1蛋白随着卵巢上皮细胞的异常增生和恶性转变其表达升高，随着临床期别的升高其表达亦升高。由此，我们认为TM4SF1蛋白与上皮性卵巢癌的发生和发展有密切关系。

动物体内实验表明［4］，增加TM4SF1蛋白的表达可缩短荷瘤动物模型的生存期，TM4SF1蛋白的高表达与肺鳞癌术后早期复发及短的生存期明显相关。因此，Gordon等［3，7］认为TM4SF1可用于预测肿瘤患者手术预后。本研究结果并未显示TM4SF1蛋白的阳性表达是上皮性卵巢癌患者的独立预后因素，这可能是由于TM4SF1蛋白在晚期上皮性卵巢癌中呈高表达，而晚期上皮性卵巢癌患者的预后本来就明显差于早期患者，同时本研究样本数量相对较少，这些可能是导致实验结果误差的原因之一。

本研究还发现，TM4SF1蛋白在细胞中的定位随着组织学类型的不同而改变，这与文献报道相似［5］。Zukauskas等［8］的研究表明，TM4SF1可以与EC细胞膜及细胞骨架蛋白相互作用，促进微小伪足的形成、促进细胞极性化和转移，但过表达的TM4SF1蛋白可破坏细胞的极性。Knust等［9］认为，细胞极性的产生是由于细胞表面或者细胞内部的某些分子在特定部位的选择性聚集而致。极性改变不仅可引起细胞形态及细胞行为的改变［10］，且与肿瘤发生、发展密切相关［11］。因此，我们猜测TM4SF1蛋白在卵巢组织不同细胞中表达部位的改变可能引起细胞极性的改变，进而导致上皮性卵巢癌的发生和发展。但免疫组化SP法属于酶标免疫组织化学方法，用光学显微镜观察蛋白亚细胞定位有一定局限性和主观性，因此TM4SF1蛋白在卵巢上皮组织细胞中的准确定位需要借助激光共聚焦显微镜或者免疫电镜进行观察，同时其定位变化可能在卵巢癌发生、发展中的作用和相关机制有待进一步研究。

总之，TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌组织中呈高表达，可能介导了卵巢癌的发生、发展，其机制有待更深入研究。

［1］ 阳志军，杨 光，蒋艳明，等.上皮性卵巢癌相关抗原的筛选和血清学检测［J］.中华妇产科杂志，2007，42（12）：834-839.

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［2013-11-18收稿］［2014-02-28修回］［编辑 阮萃才］

Expression and clinical significance of TM4SF1 protein in epithelial ovarian cancer

LIU Hui-min△，FENG Yan-ying，GAO Cai-yun△，YANG Zhi-jun（Department of Gynecologic Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）
Corresponding auther：YANG Zhi-jun.E-mail：yzj7528@126.com

Objective To investigate the expression of transmembrane 4 super family 1（TM4SF1）protein in human ovarian tissues and its relationship with clinicopathological factors.Methods The SP immunohistochemical method was used to analyze the expression of TM4SF1 protein in 16 normal ovarian epithelial tissues，23 benign ovarian tumor tissues and 55 epithelial ovarian cancer（EOC）tissues.Relationships of TM4SF1 expression with clinicopathological features of EOC and patient prognosis were analyzed.Result①EOC tissues showed a significantly higher rate of TM4SF1 protein expression（90.90%）than did benign ovarian tumor tissues（65.22%）or normal ovarian epithelial tissues（25.00%，P<0.05）.②The TM4SF1 protein showed markedly different localizations in various tissue types.In normal ovarian epithelial tissues，the protein localized primarily to the membranes and the basal surface of epithelial cells as well as cytoplasts;in benign ovarian tumors，the protein was observed mainly on the basal surface and in certain parts of tumor cell membranes；in EOC tissues，TM4SF1 showed a mainly cytoplasmic staining.③Rate of TM4SF1 protein expression was significantly higher in tissues of patients with stageⅢ-ⅣEOC than in patients with stageⅠ-Ⅱdisease（P<0.05）.The rate of TM4SF1 protein expression was also significantly higher in tissues showing low-to intermediate tumor differentiation than in well-differentiated carcinomatissues（P<0.05）.④Rate of TM4SF1 protein expression showed no significant association with histological type or amount of ascites（P>0.05），but association with FIGO stage and histological grade（P＜0.05）.⑤Cox multivariate analysis showed that positive expression of TM4SF1 protein was not an independent prognostic factor.Conclusion TM4SF1 protein is overexpressed in EOC tissue，so it may be associated with the disease.

Ovarian neoplasm；TM4SF1；Epithelial ovarian cancer；Immunohistochemistry

R737.31

A

1674-5671（2014）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.05

国家自然科学基金资助项目（81360387）；广西自然科学基金资助项目（2012GXNSFAA053135）；广西壮族自治区卫生厅重点科研课题（重2010077）

阳志军。E-mail：yzj7528@126.com