鼻咽癌间质组织中肿瘤相关纤维母细胞CD34和α-SMA的表达及其意义

党 阳 莫立根罗 元张 堃 孙 毅

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院神经外科；2病理科；广西医科大学研究生学院

临床研究

鼻咽癌间质组织中肿瘤相关纤维母细胞CD34和α-SMA的表达及其意义

党 阳 莫立根1罗 元2张 堃 孙 毅

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院神经外科；2病理科；广西医科大学研究生学院

目的 探讨鼻咽癌间质组织中肿瘤相关纤维母细胞蛋白CD34和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth musde actin，α-SMA）与鼻咽癌侵袭、转移的关系。方法 采用免疫组化SP法检测75例鼻咽癌间质组织（鼻咽癌组）和20例鼻咽黏膜慢性炎组织（对照组）中CD34和α-SMA的表达水平，分析其与鼻咽癌临床病理特征的关系。结果 鼻咽癌组中CD34仅在血管内皮细胞中表达，阳性表达率为9.33%（7/75），在纤维母细胞中无表达；而对照组中CD34不仅在纤维母细胞中呈阳性表达，在小血管中也呈阳性表达，阳性表达率为85.00%（17/20），两组差异具有统计学意义（χ2=31.542，P＜0.01）。鼻咽癌组α-SMA的阳性表达率为81.33%（61/75），明显高于对照组的10.00%（2/20），差异具有统计学意义（χ2=51.263，P＜0.01）；对不同临床病理特征的鼻咽癌患者α-SMA的表达进行分析，发现α-SMA的表达与患者年龄、性别无关（P均＞0.05），而与鼻咽癌临床分期、T分期、淋巴结转移和远处转移有关（P均＜0.05）。结论 与鼻咽黏膜慢性炎组织中的纤维母细胞相比，鼻咽癌间质组织中纤维母细胞发生表型改变，表现为CD34的表达缺失和α-SMA高表达。α-SMA与鼻咽癌浸润和转移密切相关。

鼻咽肿瘤；肿瘤相关纤维母细胞；α-SMA；CD34；免疫组化

近年来，肿瘤间质在肿瘤血管的形成和浸润、转移中的作用越来越受到人们重视［1］。研究发现，在肿瘤形成过程中，间质改变往往早于其他细胞病变。肿瘤相关纤维母细胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAFs）是肿瘤间质中重要的功能细胞，又称肌纤维母细胞，是肿瘤间质中被激活的纤维母细胞，在肿瘤与宿主的微环境平衡中担任重要的调控作用［2］。肿瘤相关纤维母细胞可以发生表型改变，表现为纤维母细胞CD34的表达缺失，而转变成α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）阳性的肌纤维母细胞［2］。本研究通过免疫组化SP法检测鼻咽癌间质组织及鼻咽黏膜慢性炎组织中纤维母细胞CD34、α-SMA的表达水平，探讨肿瘤间质中肿瘤相关纤维母细胞CD34、α-SMA与鼻咽癌侵袭性的关系，阐明其可能的分子致癌机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集来自广西医科大学附属肿瘤医院2007年1月至2008年12月收治并经病理确诊的Ⅱ～Ⅳ期鼻咽癌患者75例的临床资料，其中男性61例，女性14例，年龄23～79岁，中位年龄49岁。按′92福州分期，鼻咽癌组75例中T1期8例，T2期27例，T3期22例，T4期18例；N09例，N126例，N229例，N311例；M040例，M135例；Ⅱ期12例，Ⅲ期11例，Ⅳ期52例。以同期鼻咽黏膜慢性炎20例为对照组，经病理证实均为鼻咽黏膜慢性炎症，其中男性14例，女性6例；年龄30～70岁，中位年龄48岁。

1.2 主要试剂

即用型CD34多克隆抗体，α-SMA多克隆抗体均购自广州泉晖商业有限公司，工作浓度为1∶100；检测试剂（二抗）购自广州泉晖商业有限公司。

1.3 检测方法

应用免疫组化SP法进行免疫组织化学染色，将鼻咽癌组织蜡块连续切片，厚度为4 μm，恒温箱烘烤120 min，脱蜡和酒精梯度水化，室温下切片并经3% H2O2处理5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。用蒸馏水冲洗2 min×3次，置柠檬酸盐缓冲液中进行高温、高压抗原修复，室温下孵育5 min以封闭非特异性的背景染色。加一滴抗体CD34工作液（工作浓度为1∶100），室温放置60 min或4℃冰箱过夜。用PBS洗去一抗（5 min×3次），加一滴二抗检测剂，室温60 min。用PBS冲洗（5 min×3次），DAB浸泡5～10 min，流水冲洗干净。100%酒精脱水（3 min×3次），二甲苯透明（5 min×3次），中性树胶封片。显微镜下观察并拍照。

1.4 结果判断

CD34和α-SMA均在间质细胞的细胞质内表达，表现为棕色或棕黄色颗粒。CD34染色结果判定：镜下每张切片随机观察5个高倍视野，计算500个细胞中染色阳性的细胞数，阳性细胞＜10%为（-），阳性细胞＞10%为（+）。α-SMA染色结果判定：在显微镜下每张切片选择5个典型视野，计算每个视野100个纤维母细胞中α-SMA阳性细胞的百分率，对血管周围出现的α-SMA阳性着色不做阳性细胞计数，结果判定分为4个等级，其中阴性为无褐色颗粒，阳性细胞数＞10%为“+”，阳性细胞数＞10%～30%为“++”，阳性细胞数＞30%为“+++”。结果判定由两名病理医生独立进行，若有争议，请第三者裁定。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行统计学分析。组间CD34和α-SMA蛋白表达差异的比较采用χ2检验，两两因素的相关性采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD34、α-SMA在鼻咽癌组织及鼻咽黏膜慢性炎组织中的表达

鼻咽癌组织（鼻咽癌组）中CD34的阳性表达仅存在于血管内皮细胞，阳性表达率为9.33%（7/75），在纤维母细胞中阳性表达缺失，而鼻咽黏膜慢性炎组织（对照组）中CD34不仅在纤维母细胞中呈阳性表达，在小血管内皮细胞也呈阳性，阳性表达率为85.00%（17/20），两组差异具有统计学意义（χ2=31.542，P＜0.01）；鼻咽癌组中α-SMA在纤维母细胞中呈阳性表达，阳性表达率为81.33%（61/75），主要位于癌巢周边，呈梭形；而对照组中α-SMA多数在血管平滑肌中呈阳性表达，在纤维母细胞中的表达较弱，阳性表达率为10.00%（2/20），差异具有统计学意义（χ2=51.263，P＜0.01）。见表1、图1和图2。

表1 CD34、α-SMA在鼻咽癌组及对照组中的阳性表达［n（%）］

图1 CD34和α-SMA在鼻咽癌间质组织中的表达情况

2.2 α-SMA在鼻咽癌组织中的阳性表达与临床病理特征的关系

对不同临床病理特征的鼻咽癌患者α-SMA的阳性表达进行分析，发现α-SMA的阳性表达与患者不同年龄、性别的差异无统计学意义（P均＞0.05），而α-SMA的阳性表达与不同临床分期和T分期、是否出现淋巴结转移和远处转移的差异具有统计学意义（P均＜0.05）。随着T分期和TNM分期增加，α-SMA的阳性表达率亦增高（P均＜0.05），有淋巴结转移、远处转移患者α-SMA的阳性表达率高于无淋巴结转移、远处转移患者（P均＜0.05）。见表2。

2.3 鼻咽癌间质组织中CD34和α-SMA表达的相关性

经Spearman相关分析，鼻咽癌间质组织中CD34与α-SMA的表达呈负相关（r=-0.434，P＜0.01）。

3 讨论

肿瘤间质是近年来肿瘤相关研究的热点。研究证实肿瘤间质组织中纤维母细胞是肿瘤相关纤维母细胞的最主要来源。恶变的肿瘤上皮细胞可通过分泌可溶性的旁分泌信号机制，分泌多种生长因子、细胞因子并作用于宿主间质纤维母细胞，通过诱导和分化成为肌纤维母细胞，进一步参与合成降解细胞外基质的蛋白酶类，参与肿瘤免疫逃逸，刺激上皮细胞增殖和恶性转化，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用［3］。

表2 α-SMA在鼻咽癌组织中的阳性表达与临床病理特征的关系［n（%）］

（续表）

目前有关CAFs形成的机制尚不明确。Katsenelson等［4］认为CAFs形成的机制可能与肿瘤细胞诱导CD34阳性间质细胞的凋亡，并被α-SMA阳性肌纤维母细胞取代有关。也有学者［5，6］认为，CAFs的形成机制是由组织的间质纤维母细胞在转化生长因子β1（TGF-β1）、血小板源性生长因子（PDGF）等调控下表达α-SMA，同时下调CD34的表达，进一步分化为肌纤维母细胞。Barth等［7］推测，CAFs的表现改变可能是由于肿瘤细胞诱导CD34（+）细胞死亡，从而使α-SMA（+）细胞增殖所造成的。在肿瘤间质中，可能存在某种未知的细胞，该细胞可下调CD34的表达，同时增加α-SMA的表达。α-SMA作为一种细胞骨架蛋白，主要分布在平滑肌、肌纤维母细胞、肌上皮细胞和基底细胞内，参与构成微丝结构，是肌纤维母细胞的细胞表型转化的标志性蛋白。CD34是高度糖基化的跨膜糖蛋白，分布在各种结缔组织中，主要在淋巴造血干细胞、小血管内皮细胞、胚胎纤维母细胞和祖细胞中表达，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失。CD34阳性的纤维母细胞是1995年在子宫颈间质中首次发现，而后在乳腺、胃肠道等器官组织中发现，在维持正常的间质结构中起到重要作用。作为一种多向分化幼稚间叶细胞，当其分化成熟后即不再表达CD34。近年研究发现胃癌［6，8］、非小细胞肺癌［9］、结直肠腺癌［10］间质中纤维母细胞表现为CD34的表达缺失，而转变为α-SMA阳性肌纤维母细胞的特征。本研究采用免疫组化SP法检测鼻咽癌间质组织及鼻咽黏膜慢性炎组织中纤维母细胞CD34、α-SMA的表达，结果发现，CD34在鼻咽黏膜慢性炎组织中的表达明显高于鼻咽癌间质组织中的表达（P＜0.05），而α-SMA在鼻咽癌间质组织中的表达明显高于鼻咽黏膜慢性炎组织中的表达（P＜0.05）。α-SMA与CD34的表达呈负相关。实验结果提示鼻咽癌组织中同样存在间质纤维母细胞发生表型的改变，表现为CD34阳性表达的缺失和α-SMA阳性表达。这与文献报道［8，9］结果一致。肖光等［9］在探讨非小细胞肺癌中肿瘤相关纤维母细胞蛋白的表达与癌侵袭的关系，发现非小细胞肺癌的癌细胞可能通过分泌TGF-β1作用于肿瘤间质，促进CD34阳性的纤维母细胞转变为α-SMA阳性的肌纤维母细胞。鼻咽癌中癌细胞是否也通过分泌TGF-β1作用于肿瘤间质，促进CD34阳性的纤维母细胞转变为α-SMA阳性的肌纤维母细胞，尚待今后进一步深入研究。

肿瘤侵袭和转移表现为多步骤、多因素参与的复杂过程。近年研究报道证明，肿瘤组织中肿瘤间质在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。CAFs在肿瘤发展、浸润和转移中的作用越来越受到人们的重视［11］。鼻咽癌在中国岭南地区发病率高，发生浸润和转移率亦高，其发生机制有待深入研究［12］。本研究显示，在鼻咽癌间质组织中，α-SMA阳性表达率与鼻咽癌T分期、淋巴结转移、远处转移和临床分期有相关性（P均＜0.05）。随着T分期增加，α-SMA阳性表达率升高，即α-SMA的表达强弱与鼻咽癌浸润程度一致。有淋巴结转移、远处转移患者其α-SMA的阳性表达率高于无淋巴结转移、远处转移者，说明α-SMA阳性的纤维母细胞与鼻咽癌淋巴结转移和远处转移密切相关，提示α-SMA阳性的纤维母细胞与鼻咽癌的进展存在一定的关系。推测其原因可能与α-SMA阳性纤维母细胞能够阻碍免疫细胞与鼻咽癌细胞之间的信号传递，使鼻咽癌细胞逃避免疫监视而导致浸润、转移。但其真正致癌的分子机制有待今后更深入地研究。

肿瘤的发生、发展既由癌基因和抑癌基因来调控，也同时依赖由间质形成的微环境的作用。深入研究肿瘤间质微环境的相互关系，有望通过微环境来控制肿瘤的发展，而肿瘤相关纤维母细胞的发现对探讨肿瘤的发生、发展意义重大。体外实验［13］证明，抑制CAFs的产生可抑制肿瘤生长。从肿瘤相关纤维母细胞靶点深入研究抑制肿瘤的方法有助于探索肿瘤治疗的新途径。

［1］ 林贵南，吕 跃，蒋湘俐，等.Ezrin蛋白在鼻咽癌组织中的表达及其预后的相关研究［J］.广东医学，2010，31（7）：869-871.

［2］ 郑厚普，党 阳，莫立根.肿瘤相关纤维母细胞与肿瘤的研究进展［J］.中国癌症防治杂志，2011，3（4）：341-344.

［3］ 范松青，张文玲，徐丽娜，等.组织微阵列技术研究肿瘤转移相关基因在鼻咽癌中的表达与临床意义［J］.生物化学与生物物理进展，2009，36（5）：616-623.

［4］ Katsenelson NS，Shurin GV，Bykosvkaia SN，et al.Humans mall cell lung carcinoma and carcinoid tumor regulate dendritic cell maturation and function［J］.Mod Pathol，2001，14（1）：40-45．

［5］ Fuyuhiro Y，Yashiro M，Noda S，et al.Upregulation of cancer-associated myofibroblasts by TGF-β1from scirrhous gastric carcinoma cells［J］.Br J Cancer，2011，105（7）：996-1001.

［6］ Fuyuhiro Y，Yashiro M，Noda S，et al.Upregulation of cancer-associated myofibroblasts by TGF-β1from scirrhous gastric carcinoma cells［J］.Br J Cancer，2011，105（7）：996-1001．

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［8］高 海，吕常帅，王金申.CAFs在胃癌组织中的表达及与临床病理特征的关系［J］.中国现代普通外科进展，2012，15（10）：796-799.

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［10］韦康来，梁秀就，冯振博.结直肠息肉、腺瘤及腺癌中间质细胞CD34和α-SMA的表达及其意义［J］.广东医学，2011，32（19）：2534-2535.

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［2014-03-28收稿］［2014-05-20修回］［编辑 阮萃才］

Expression and clinical significance of tumor-associated CD34 fibroblasts and α-SMA in nasopharyngeal carcinoma interstitium

DANG Yang，MO Li-gen1，LUO Yuan2，ZHANG Kun，SUN Yi（1Department of Neurosurgery；2Department of Pathology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

MO Li-gen.E-mail：ligenmo@163.com

Objective To investigate the relationship of tumor-associated CD34 fibroblasts and α-smooth muscle actin（α-SMA）in the nasopharyngeal carcinoma interstitium with invasion and metastasis by nasopharyngeal carcinoma.Method Expression of CD34 and α-SMA was measured by immunohistochemistry in 75 patients with nasopharyngeal carcinoma and 20 patients with chronic inflammation of the nasopharyngeal mucosa.Expression levels were compared with clinicopathological features of nasopharyngeal carcinoma using the supervised two-step method.Result Of the 75 cancer patients，7（9.33%）showed CD34 expression only in blood vessels and not in fibroblasts.In contrast，17 of 20 control patients（85.00%）showed CD34 expression not only in fibroblasts but also in small blood vessels of chronically inflamed tissue.These expression differences between the two groups were significant（χ2=31.542，P＜0.01）.The proportion of patients expressing α-SMA was significantly higher in the nasopharyngeal carcinoma group（61/75，81.33%）than in the control group（2/20，10.00%；χ2=51.263，P＜0.01）.Correlation analysis of α-SMA expression with clinical andpathological features of nasopharyngeal carcinoma patients showed that the protein level was not related to age or gender（P＞0.05），but it was associated with clinical stage，T stage，lymphatic metastasis and distant metastasis（P＜0.05）.Conclusion Fibroblasts in the nasopharyngeal carcinoma interstitium show phenotypic differences from the fibroblasts of chronically inflamed nasopharyngeal mucosa.These changes include lack of CD34 expression and overexpression of α-SMA.Expression levels of α-SMA appear to be related to nasopharyngeal carcinoma metastasis.

Nasopharyngeal neoplasm；Tumor-associated fibroblasts；α-SMA；CD34；Immunohistochemistry

R739.63

A

1674-5671（2014）02-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.02.09

广西自然科学基金资助项目（2011GXNSFA018247）；广西卫生厅科研基金资助项目（重2010069）【通信作者】莫立根。E-mail：ligenmo@163.com