虾青素通过JNK和p38MAPK通路抑制Aβ诱导的神经毒性损伤

王洪权，王玉敏，赵伟丽，张俊毅，崔其福

(赤峰学院附属医院：1. 神经内五科；2. 肿瘤内科；3. 病理科，内蒙古赤峰市 024005)

大量研究表明，氧化应激(oxidative stress, OS)损伤在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的发病机制和进展中发挥着重要的作用[1]。OS与Aβ之间形成恶性循环，促进AD的发生[2-3]。鉴于OS在AD中的重要作用，因此，针对抗OS的治疗策略对AD的发生和发展是有效的治疗途径。虾青素(astaxanthin, ATX)为叶黄素类化合物，其主要存在于特定的海洋动物和植物，如鱼、虾和海藻内[4]。ATX是强效抗氧化剂，但是没有β-胡萝卜素的活性。ATX具有许多重要的生物功能[5]。最重要的是 ATX的抗氧化活性[6]。有报道显示，ATX可以在体外抑制6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA) 诱导的神经元凋亡的发生[7-8]。ATX可以通过抑制氧化应激、减少谷氨酸的释放和抗凋亡来减少脑组织因缺血引起的相关损伤[9]。前人研究表明ATX可以抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤，但其机制不清楚。本研究探讨素ATX是否通过MAPK通路来抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤。

1材料与方法

1.1材料Astaxanthin购自Enzo Life Sciences Int公司，MTT购自Sigma-Aldrich公司，Aβ25-35购自GL Biochem公司，H2DCF-DA购自Invitrogen公司，Rabbit anti-phospho-p38(Thr180/Tyr182)antibody(#9211)，Rabbit anti-p38 antibody (#9212)，Rabbit anti-phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185) antibody(#9251)和Rabbit anti-SAPK JNK antibody(#9252)购自CST公司。

1.2维状Aβ25-35的制备Aβ25-35溶于灭菌双蒸水，贮存浓度为2 mmol/L，于37 ℃条件下孵育7 d，使其纤维化。

1.3SH-SY5Y细胞培养SH-SY5Y细胞用DMEM培养基(含青霉素100 IU/mL，链霉素100 IU/mL)加入100 mL/L胎牛血清培养。于37 ℃、50 mL/L CO2条件下培养，选取对数生长期细胞进行实验。

1.4MTT检测MTT是一种四甲基偶氮哩盐，在活细胞线粒体玻拍酸脱氢酶的作用下被还原成蓝色甲攒颗粒，其形成量与活细胞数和线粒体玻拍酸脱氢酶的活性呈正相关。SH-SY5Y细胞以1×104个/孔密度接种于96孔板中，100 μL/孔。于37 ℃ 50 mL/L CO2孵箱中培养过夜。12 h后，吸弃上清液。96孔板中处理好的细胞，每孔加入20 μL(5 mg/mL)MTT，37 ℃孵育4 h，并加入150 μL DMSO，振荡8 min，待紫色结晶充分溶解后，置酶标仪上测各孔光吸收值(A)。然后以A值求细胞存活率。

1.6Westernblot法检测蛋白表达参照文献[19]的方法。

1.7统计分析结果以均数±标准误表示。资料采用GraphPad Prism 4.0 software(GraphPad Software, Inc.,San Diego, CA)分析软件进行统计分析，两组数据比较用studentttest，多样本均数比较用单因素方差分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1虾青素改善Aβ25-35诱导的细胞活力的降低我们首先检测ATX(分子结构式见图1)对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞活力的影响。ATX(1～10 μmol/L)预处理1.5 h后，25 μmol/L Aβ25-35处理细胞24 h(表1)，Aβ25-35明显降低细胞活力。细胞活力检测显示，ATX(5和10 μmol/L)预处理组可以明显抑制Aβ25-35诱导的细胞活力的降低。

图1 虾青素的分子结构图

表1 ATX对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞存活率下降的影响

药物预处理细胞1.5 h后加入25 μmol/L Aβ25-35作用24 h；与正常对照组比较，##P<0.01；与Aβ25-35组比较，*P<0.05,**P<0.01。

2.2虾青素改善Aβ25-35对细胞内ROS产生的影响Aβ诱导的神经元损伤和死亡的机制中有氧化应激机制的参与。用荧光探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)来检测细胞内活性氧簇ROS的聚集。H2DCF-DA进入细胞后能使细胞内的过氧化物、氢过氧化物等氧化分解为二氯荧光素(Dichlorofluorescein, DCF)而产生荧光，其荧光强度与活性氧的浓度呈线性关系。25 μmol/L Aβ25-35处理的SH-SY5Y 细胞组，其荧光强度明显增高，而ATX预处理可以剂量依赖性降低Aβ25-35引起的细胞内ROS的产生(表2)。结果表明，ATX可以抑制或清除Aβ25-35处理诱导的ROS产生。

表2 ATX对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞ROS产生的影响

药物预处理细胞4 h后加入25 μmol/L Aβ25-35作用24 h；与正常对照组比较，##P<0.01；与Aβ25-35组比较，**P<0.01。

2.3虾青素抑制Aβ25-35诱导的JNKs的激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)家族的激活参与氧化应激诱导的细胞死亡进程。目前，已知JNKs的激活介导Aβ诱导的细胞凋亡过程[10]。因此，我们接下来检测ATX对Aβ25-35引起的JNKs激活的影响。JNKs的苏氨酸183/酪氨酸185(Thr183/Tyr185)位点磷酸化是其激活的主要形式。用识别Phospho-SAPK/JNKs (Thr183/Tyr185) 的特异性抗体进行的分析显示，SH-SY5Y细胞经Aβ25-35作用24 h可引起JNKs(图2)的激活，而ATX预处理可以剂量依赖性抑制Aβ25-35引起的这种激活。

2.4虾青素抑制Aβ25-35诱导的p38MAPK的激活目前，已知p38MAPK的激活亦介导Aβ诱导的细胞凋亡过程[10]。因此，我们接下来检测ATX对Aβ25-35引起的p38MAPK的激活的影响。p38MAPK苏氨酸180/酪氨酸182(Thr180/Tyr182)位点磷酸化是其激活的主要形式。用识别Phospho-p38MAPK(Thr180/Tyr182)的特异性抗体进行的分析显示，SH-SY5Y细胞经Aβ25-35作用24 h可引起p38MAPK(图3)的激活，而ATX预处理可以剂量依赖性抑制Aβ25-35引起的这种激活。

图2 ATX对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞中JNK激活的影响

图3 ATX对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞中p38MAPK激活的影响

3讨论

AD是一种老年性中枢神经系统退行性疾病，其发病率随着人口的老龄化而迅速增长。该病是老龄人口罹患痴呆最常见的原因，已成为继心血管疾病、癌症和中风之后的又一严重危害人类健康的疾患。AD的病因目前仍不明确，因此尚无确切有效的治疗方法。故探索预防和治疗AD的有效措施刻不容缓，对阿尔茨海默病的治疗有着重要的医学和社会意义。

大量研究表明，OS损伤在AD的发病机制和进展中发挥着重要的作用[1]。Aβ在特定脑区的聚集,介导OS损伤在AD的发生和进展中发挥主要的作用[1]。Aβ可以在体内和体外诱导OS[11]，而OS可以增加Aβ的产生和聚集[2]。最近研究显示，OS促进Aβ的产生和聚集，反过来Aβ又诱导OS，进而增加Aβ的产生，如此在OS与Aβ之间形成恶性循环，促进AD的发生[2-3]。鉴于OS在AD中的重要作用，因此，针对抗OS的治疗策略对AD的发生和发展是有效的治疗途径。因此，一项具有广泛前景的预防和治疗AD的方法就是减弱或抑制Aβ诱导的氧化应激损伤。同时一些天然抗氧化剂，如石杉碱甲(huperzine A)[12]、姜黄(curcumin)[13]，银杏(ginkgo biloba)[14]、丹参酮(tanshinone IIA)[15-16]、红景天甙(salidroside)[17]和番茄红素(lycopene)[18]和人参皂苷Rb1[20]已经证实可以抑制Aβ诱导的氧化应激损伤。

ATX其主要存在于特定的海洋动物和植物，如鱼、虾和海藻内。ATX是强效抗氧化剂，具有多种药理学作用。有报道显示，ATX可以在体外抑制6-羟多巴胺 (6-hydroxydopamine，6-OHDA)诱导的神经元凋亡的发生。ATX可以通过抑制氧化应激、减少谷氨酸的释放和抗凋亡来减少脑组织因缺血引起的相关损伤。同时，ATX在AD中的作用引起了研究者的关注。研究表明，ATX前人研究表明ATX可以抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤，但其机制尚不清楚。本研究表明ATX可以通过抗氧化机制抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤。许多研究表明，OS参与Aβ诱导的神经细胞损伤机制，ROS产生介导Aβ损伤机制。本研究表明，ATX可以抑制Aβ25-35诱导的细胞内ROS的过度产生(表2)。OS是MAPK激酶激活的主要刺激因素，是MAPK激酶激活参与凋亡的信号转导通路。研究显示JNK和p38 MAPK的激活与细胞毒性损伤相关，Aβ可促进二者的激活进而诱导神经毒性损伤的发生。本研显示Aβ25-35激活JNK和p38 MAPK，而ATX可以剂量依赖性抑制Aβ25-35诱导的JNK(图2)和p38 MAPK(图3)激活。这一结果表明，ATX通过抑制JNK和p38 MAPK激活，进而抑制Aβ25-35诱导的细胞损伤。

总之，我们的研究表明虾青素可以抑制Aβ25-35引起的ROS的产生增加，进而抑制JNK和p38 MAPK激活，从而发挥其神经保护作用。在AD中具有神经保护作用，这种保护机制与其抑制JNK和p38MAPK的激活有关。本研究为探讨虾青素作为AD的潜在预防和治疗药物奠定了坚实的实验基础。

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