婆罗双树样基因4在儿童急性白血病中的表达及临床意义*

2014-06-28刘江华王艳珍梁绍燕安曦洲

中国肿瘤临床 2014年20期

刘江华于洁张妮王艳珍梁绍燕安曦洲

刘江华于洁张妮王艳珍梁绍燕安曦洲

目的：探讨婆罗双树样基因4（sal-like 4，SALL4）在儿童急性白血病中的表达及其临床意义。方法：采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学技术检测50例初诊急性白血病患儿SALL4 mRNA及蛋白的表达量，以15例免疫性血小板减少性紫癜（immune thrombocytopenic purpura，ITP）为对照；动态观察5例白血病患儿初诊和完全缓解后SALL4 mRNA的表达变化；分析SALL4 mRNA表达量与临床指标的关系。结果：SALL4 mRNA在初诊急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）、急性髓细胞白血病（AML）中的表达量分别为13.89（1.00～63.15）、11.12（2.31～56.59），显著高于对照组［1.00（0.29～1.71）（P＜0.01）］，在急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）中的表达量1.48（0.87～4.81）与对照组无显著差异（P＞0.05）；SALL4蛋白表达检测结果与SALL4 mRNA表达结果一致；急性白血病患儿完全缓解后SALL4 mRNA表达量0.98（0.22～1.09）较初诊时［28.64（11.20～87.46）］显著降低（P＜0.01）。SALL4 mRNA的高表达与外周血高白细胞计数、高危分型、诱导化疗末期微小残留病（minimal residual disease，MRD）呈正相关（r=0.424、r=0.403、r=0.393，P均＜0.05）；与发病年龄，性别，肝、脾、淋巴结肿大等因素无相关性（P＞0.05）。结论：SALL4可能促进了儿童B-ALL、AML的发生发展，并有望成为监测治疗效果和判断预后的新指标。

SALL4 急性白血病儿童危险度微小残留病

SALL4是近年来新发现的癌基因，位于20q13，编码一种锌指蛋白转录因子，在维持胚胎干细胞的多能性和自我更新方面起着重要作用，其突变可导致Okihiro综合征和IVIC综合征［1-4］。研究发现，SALL4在多种肿瘤组织中存在异常表达，如肝癌［5］、乳腺癌［6］、多发性骨髓瘤［7］等。在造血细胞发育过程中，SALL4主要表达于CD34+的造血干/祖细胞，随着细胞的分化成熟，其表达量逐渐下降，在成熟造血细胞中几乎不表达，而在白血病细胞中又出现了高表达，提示SALL4的异常表达与白血病的发生密切相关［8］。但SALL4在儿童急性白血病中的表达和作用目前鲜见报道，本研究从mRNA和蛋白两方面研究SALL4在各型儿童急性白血病中的表达情况，分析SALL4的表达量和临床MICM分型、危险度、MRD等预后因素的相关性，试图探讨SALL4在儿童急性白血病中的作用及临床意义，以期寻找未被识别的危险因素和新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料全部骨髓标本均来源于2012年10月至2013年10月在重庆医科大学附属儿童医院住院治疗和门诊就诊的患儿，其中急性白血病初诊患儿50例（包括B-ALL 24例，T-ALL 4例，AML 22例），均经MICM分型确诊，男31例，女19例，中位年龄6（3～11）岁，其中5例收入对应的缓解期标本作为动态监测时使用。ITP患儿15例，其中男7例，女8例，中位年龄4（2～8）岁。研究已取得医院伦理委员会的批准和家长的知情同意。

1.1.2 主要试剂和仪器 TRIzol试剂购自美国invitrogen公司，逆转录试剂盒及SYBR GreenⅡ荧光染料购自日本Takara公司，即用型免疫组织化学ElivisionTM Super试剂盒及DAB试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；SALL4多抗购自美国GeneTex公司；CFX 96 Cycler荧光定量PCR仪为购自美国Bio-rad公司产品；光学显微镜为日本Nikon公司产品。

1.2 方法

1.2.1 骨髓标本的收集及细胞涂片的制备 EDTA-Na2抗凝管收集患儿骨髓标本2 mL，加入3 mL红细胞裂解液混匀，4℃静置10 min，1 000 rpm离心5 min，弃废液。重复裂解红细胞1次，PBS清洗。调整细胞密度为106/mL制成细胞悬液，取适量均匀涂在防脱玻片上，干燥后用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗后暂存于-20℃备用。

1.2.2 总RNA的提取、逆转录及荧光定量PCR 按TRIzol试剂说明书提取骨髓单个核细胞（BMMNC）总RNA，NanoDrop 2 000分光光度计测定RNA浓度及纯度，A260/A280在1.8～2.1用于后续逆转录反应。逆转录条件为37℃15 min，85℃5 s。以合成的cDNA为模板进行荧光定量PCR反应。SALL4引物序列为：上游5'-TGCAGCAGTTGGTGGAGAAC-3'，下游5'-T CGGTGGCAAATGAGACATTC-3'，扩增产物长度为68 bp；内参基因β-actin的引物序列为：上游5'-AAG ATGACCCAGATCATGTTTGAGACC-3'，下游5'-GCC AGGTCCAGACGCGGAT-3'，扩增产物长度191 bp。引物均经Primer BLAST比对验证并经上海英骏生物工程有限公司合成。Real-time PCR扩增条件为：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40个循环，65～95℃熔解曲线。记录样本的循环阈值（CT值），ΔCT=CTSALL4-CTβ-actin，ΔΔCt=（疾病组ΔCT）-（对照组ΔCT），以2-ΔΔCt相对定量法计算疾病组相对于对照组SALL4表达水平的高低。部分标本经RT-PCR反应验证，产物在3%琼脂糖凝胶上成像。

1.2.3 免疫组织化学检测SALL4蛋白表达水平取出待测玻片，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶的活性，0.3%Ttriton X-100渗透，山羊血清封闭。加SALL4一抗（稀释度为1：200）4℃孵育过夜，阴性对照组用PBS替代一抗。室温下复温30 min，PBS冲洗5 min，3次。按试剂盒说明孵育二抗，DAB显色，苏木素染核，PBS终止反应。晾干，中性树胶封片后观察拍照。

1.2.4 免疫组织化学结果 SALL4蛋白表达定位于细胞核，胞核染色为黄色的视为阳性。结果判读标准［9］：400倍显微镜下每张玻片随机选取5个视野观察染色强度和阳性细胞百分率。染色强度评分：0分为无着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。阳性细胞百分率评分：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。将两者分数相加：＜2分为不表达（-），2～3分为低度表达（+），4～5分为中度表达（++），6～7分为高度表达（+++）。0～3分为阴性组，4～7分为阳性组。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。偏态分布计量资料以M（P25-P75）表示，两组间比较采用非参数Mann-Whitney检验，多组间多重比较采用Krusikal-Wallis检验，Bonferroni法校正检验水准；相关性分析采用Spearson检验。样本率比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SALL4 mRNA在各组中的表达水平

SALL4 mRNA在初诊B-ALL、AML、T-ALL中的表达量分别为13.89（1.00～63.15）、11.12（2.31～56.59）、1.48（0.87～4.81），在对照组中的表达量为1.00（0.29～1.71）。SALL4 mRNA在B-ALL、AML中的表达量显著高于对照组（P＜0.01），在T-ALL中的表达量与对照组无显著性差异（P＞0.05，图1）。动态观察5例白血病患儿治疗前后SALL4 mRNA表达水平变化，发现完全缓解后SALL4 mRNA的表达量［0.98（0.22～1.09）］显著低于初诊时的表达量［28.64（11.20～87.46）］，见图2。

2.2 SALL4蛋白在各组中的表达水平

SALL4蛋白在初诊B-ALL、AML、T-ALL的表达阳性率分别为83.33%（20/24）、86.36%（19/22）、0（0/4），在15例对照中全部呈阴性表达。SALL4蛋白在B-ALL、AML中的表达显著高于对照组（P＜0.01），而在T-ALL中的表达与对照组无统计学差异（P＞0.05），与SALL4 mRNA的表达结果一致（图3）。

2.3 SALL4 mRNA表达量与临床指标的关系

SALL4 mRNA的高表达与外周血高白细胞计数、高危分型、诱导化疗末期MRD正相关（r=0.424、r=0.403、r=0.393、P均＜0.05）；与性别、年龄、肝、脾、淋巴结肿大无明显相关性（P＞0.05，表1）。

图1 琼脂糖凝胶电泳验证SALL4 mRNA在初诊白血病和对照中的表达Figure 1 Agarose gel electrophoresis verification of SALL4 mRNA expression in initially diagnosed cases of acute leukemia and controls

图2 琼脂糖凝胶电泳验证SALL4 mRNA在白血病患儿初诊期和缓解期的表达Figure 2 Agarose gel electrophoresis verification of SALL4 mRNA expression in patients with acute leukemia after initial diagnosis and remission stages

图3 免疫组织化学检测SALL4蛋白在各组中的表达（H&E×400）Figure 3 SALL4 protein expression in various groups detected by immunohistochemistry（H&E×400）

表1 46例B-ALL、AML患儿SALL4 mRNA表达量和临床指标的关系Table 1 Relationship of SALL4 mRNA expression with clinical indicators of 46 children with B-ALL or AML

表1 46例B-ALL、AML患儿SALL4 mRNA表达量和临床指标的关系（续表1）Table 1 Relationship of SALL4 mRNA expression with clinical indicators of 46 children with B-ALL or AML

3 讨论

急性白血病是儿童恶性肿瘤中居首位的重大疾病，年发病率为3～5/10万，严重威胁着儿童的生命和健康。在规范化疗和支持治疗下，儿童急性淋巴细胞白血病（急淋，ALL）的5年无病生存率可达80%，急性髓细胞白血病（急非淋，AML）可达60%［10-11］。但仍有部分患儿存在难治和复发等问题，是影响儿童白血病疗效的主要原因，提示仍有许多危险因素未被识别，因此识别危险因素并有针对性地进行治疗，是提高疗效的重要途径。

SALL4是果蝇Spalt的同源异型基因，Spalt调节着果蝇头、尾和末端指节的发育［8］。SALL4的异常表达与血液系统恶性肿瘤的发生有关，过表达SALL4的转基因小鼠出现了类似骨髓增生异常综合征的表现，最终发生了AML［7］。本研究通过荧光定量PCR和免疫组织化学技术检测了SALL4在各型儿童急性白血病中的表达情况，发现SALL4在儿童B-ALL、AML中的表达量显著高于对照组，提示SALL4可能促进了儿童B-ALL、AML的发生发展。另外，本研究动态监测了5例白血病患儿初诊和化疗后完全缓解状态下SALL4 mRNA表达量的变化，结果显示随着肿瘤细胞的减少和病情的缓解，SALL4 mRNA的表达量显著下降，印证了SALL4特异表达于白血病细胞和CD34+的造血干细胞而不表达于成熟造血细胞的结论，提示SALL4有可能成为儿童B-ALL、AML监测治疗反应和病情状态的指标。

SALL4参与白血病发生的机制目前尚未得到全面而准确的阐释。郭野等［12］通过RNA干扰技术抑制SALL4的表达后，Wnt信号通路下游因子β-catenin、C-Myc、Cyclin-D1的表达也随之下调，推测SALL4可能通过激活造血干细胞调控的重要通路Wnt/ β-catenin信号通路发挥致癌作用；也有研究认为，SALL4可能与组蛋白去乙酰化酶复合体相互作用，通过表观遗传学机制抑制抑癌基因PTEN的表达发挥癌基因的作用［13-14］。

SALL4在儿童AML和B-ALL中的表达量显著高于对照组，而在T-ALL组中的表达量却和对照组并无差异。在对肿瘤细胞株的研究中发现，只有来源于AML、B-ALL的细胞株才有SALL4高表达，而来源于T系的Jurkat细胞株SALL4呈阴性表达，提示AML和B-ALL可能有共同的起源和致病通路，有研究认为它们可能都来源于一个CD34+CD19+CXCR4-的细胞群［13］。

目前，临床和实验研究已经发现了多种与儿童白血病预后相关的危险因素，根据危险因素进行危险度分组和评估疗效，是避免标危患儿过度治疗，高危患儿治疗不足的重要手段。细胞遗传学异常和体细胞基因突变在判断预后中发挥着重要作用，许多指标已被明确纳入危险因素评估体系中，如BCR/ ABL和MLL/AF4融合基因阳性被纳入高危组，预后不良；FLT3内部串联重复突变阳性患儿有较低的诱导缓解率（70%）和5年无病生存率（29%）及总生存率（32%）［10］。本研究纳入的ALL和AML患儿根据相应的诊疗方案，依据年龄、初诊时外周血白细胞计数、免疫分型、融合基因、染色体、治疗反应、MRD等因素将患者分别纳入标危，中危和高危，以危险度分层为指导调整化疗方案，提高急性白血病的疗效。本研究将患儿SALL4 mRNA的表达量和危险因素进行相关性分析，发现SALL4 mRNA高表达和高危分型正相关，提示SALL4可能是儿童急性白血病预后不良的相关危险因素。

MRD是白血病经治疗缓解后体内残存的白血病细胞，是白血病预后的独立因素之一。动态监测MRD，可以直接反映患者体内的肿瘤细胞负荷量，无论在任何时间段，只要MRD≥10-4，都有复发的危险［15］。St Jude儿童医院曾提出了儿童ALL完全缓解的分子学标准，将诱导缓解末期MRD＜10-4定义为完全缓解，MRD＞10-2定义为未缓解，二者之间定义为部分缓解［16］。本中心采用流式细胞术对诱导化疗末期MRD水平进行检测，将≥10-4定义为MRD阳性，＜10-4定义为MRD阴性。将MRD作为指导化疗的指标，调整治疗方案。本研究分析了SALL4 mRNA的表达量和诱导化疗末期MRD的关系，结果显示MRD阳性组SALL4 mRNA的表达量显著高于MRD阴性组，提示SALL4具有MRD样作用，在监测疗效、预测复发等方面可能发挥着重要作用。由于MRD阳性者的病例数较少，该结论尚需扩大样本数进一步研究证实。

本研究从mRNA和蛋白两方面均显示SALL4在儿童B-ALL、AML中存在高表达，并随着病情的缓解而下降，提示SALL4可能促进了儿童B-ALL、AML的发生发展，并有望成为监测治疗效果和判断预后的指标。

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（2013-12-06收稿）

（2014-07-20修回）

（本文编辑：贾树明）

SALL4 expression in children with acute leukemia and its clinical significance

Jianghua LIU,Jie YU,Ni ZHANG,Yanzhen WANG,Shaoyan LIANG,XizhouAN

XizhouAN;E-mail:173118110@qq.com
Department of Hematologic Neoplasm,Children's Hospital of Chongqing Medical University;Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders;Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing;Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders,Chongqing 400014,China
This work was supported by the Medical Scientific Research Project of Chongqing Municipal Health Bureau(No.2011-2-208)

Objective:To investigate the expression of sal-like 4(SALL4)gene in children with acute leukemia and analyze its clinical significance.Methods:Real-time PCR and immunohistochemistry were used to detect SALL4 mRNA and SALL4 protein expressions in 50 patients initially diagnosed with acute leukemia and in 15 patients with immune thrombocytopenic purpura(ITP),which served as controls.Changes were detected in SALL4 mRNA expression from preliminary diagnosis and after complete remission of 5 acute leukemia patients.The relationship between SALL4 mRNA expression and clinical indicators was analyzed.Results:SALL4 mRNA expression is higher in initially diagnosed B-ALL[13.89(1.00-63.15)]and AML[11.12(2.31-56.59)]than in ITP controls[1.00 (0.29-1.71)](P＜0.01).SALL4 mRNA expression in initially diagnosed T-ALL[1.48(0.87-4.81)]and in controls showed no significant difference(P＞0.05).SALL4 protein expression is in agreement with SALL4 mRNA expression.SALL4 mRNA expression significantly decreased in complete remission stage[0.98(0.22-1.09)]than in acute phase[28.64(11.20-87.46)]in acute-leukemia patients(P＜0.01).High SALL4 mRNA expression level is positively correlated with high white blood cell count,high risk classification,and high minimal-residual disease at the end of induction chemotherapy(r=0.424,r=0.40,and r=0.393,respectively;P＜0.05),but not with age, gender,hepatomegaly,splenomegaly,and lymphadenectasis(P＞0.05).Conclusion:SALL4 was found to play an important role in promoting childhood B-ALL and AML,which promises a new target for monitoring the therapeutic effects and evaluating the prognosis of childhood B-ALL andAML.

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