N-糖苷酶基因在脑膜炎败血伊丽莎白金菌临床分离株中的分布

李蒙，孙桂芹，陈菁，李天胜，王蕾，策力木格，陈力

复旦大学基础医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

脑膜炎败血伊丽莎白金菌(Elizabethkingiameningoseptica，EM)是非发酵革兰阴性杆菌，可广泛分布于土壤和水环境中[1]。该菌又名脑膜脓毒金黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum, FM；Chryseobacteriummeningosepticum, CM)，2005年后基于16S rRNA序列分析后被归于伊丽莎白金菌属[2]。EM为条件致病菌，可引起新生儿脑炎和败血症[3,4]。植入性医疗器械或其他污染因素[5]使其院内获得性感染病例增多，尤其是在重症监护室(intensive care unit, ICU)中。据报道，中国台湾地区EM感染的发病率从1999年的7.5/10万入院病例上升至2006年的35.6/10万入院病例[6]；2006～2007年中国非发酵革兰阴性杆菌耐药监测网结果显示，EM临床分离株占非发酵革兰阴性杆菌临床分离株的1.02%[7]。EM对医院常用的头孢类、碳青霉烯类、氨基糖苷类抗生素呈现天然耐多药[8]，感染后2周内病死率高达25%以上[6,9]。迄今对EM的研究多集中在临床病例报道和耐药性研究，关于其快速检测方法和特征性分子机制的研究较少。

N-糖苷酶(peptide:N-glycanase, PNGase)是去糖基化酶的一种，专一识别N-糖蛋白或N-糖肽中的Asn-X-Ser/Thr序列，将Asn上连接的糖链从底部完整切除[10]。PNGase最早于1977年从杏仁中发现，并命名为PNGase A，随后发现其在酵母、线虫、拟南芥、鱼、小鼠、人等真核生物中广泛存在，参与生长、发育及降解错误折叠的糖蛋白等过程[11-14]。但在原核生物中PNGase极为罕见，仅在EM中发现了此类酶，并命名为PNGase F[15]。PNGase F是糖生物学研究中最常用的工具酶，对研究细胞表面糖蛋白结构与功能的关系、糖链对糖蛋白功能的影响和糖链结构的分析具有重要意义[16-19]，但PNGase F在EM中的生物学功能仍未知。

本实验室前期对临床分离的一株EM菌株FMS-007进行全基因组测序(GenBank序列号：CP006576)分析并验证功能，发现该菌株中可能同时存在2种PNGase，即PNGase F和PNGase F-Ⅱ。FMS-007菌株中的PNGase F-Ⅱ与PNGase F在核苷酸水平和氨基酸水平的同源性不高，分别为46.9%和21.8%，但蛋白结构与PNGase F相似，并具有与PNGase F相同的切除糖肽和糖蛋白上N-连接寡糖链的功能(已投稿)。PNGase F和PNGase F-Ⅱ这2个同工酶同时存在预示PNGase可能在EM的生活史中具有重要生理功能。本研究利用核酸检测技术，分析了PNGase F和PNGase F-Ⅱ在浙江省3家三级甲等医院65株EM临床分离株中的分布情况，为建立特异聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测方法和研究其生物学意义奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株2010年7月～2012年12月于浙江省绍兴市人民医院、台州市中心医院和宁波市李惠利医院收集EM临床分离株。无菌操作采集患者血液、下呼吸道分泌物、尿液及创口分泌物等标本，35 ℃培养18～24 h，分离获得纯培养。剔除同一患者多次检出的重复菌株，共收集EM菌株65株，其中绍兴市12株、台州市7株、宁波市46株。所有菌株经法国生物梅里埃公司VITEK-2自动微生物鉴定分析系统鉴定为EM。

1.1.2仪器和试剂细菌基因组DNA抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeSTAR®Max DNA Polymerase和DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司；C1000 Touch梯度PCR仪和Sub-Cell GT水平电泳槽为美国Bio-Rad公司产品；FluorChem E凝胶成像系统为美国Protein Simple公司产品。

1.1.3引物设计与合成本实验室已完成一株来自浙江省绍兴市人民医院的EM临床分离株FMS-007的全基因组测序(GenBank序列号：CP006576)，根据FMS-007全基因组序列中PNGaseF基因和PNGaseF-Ⅱ基因进行引物设计。FMS-007的PNGaseF基因与ATCC 13253的同源性为77%，故针对ATCC 13253中的PNGaseF基因设计了第2对引物。16SrRNA引物为细菌检测通用引物[20]。 所有引物 (表1) 送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1PCR引物序列

Tab.1PCRprimers

PrimerSequenceSize (bp)16S rRNA F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1 500 R5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'PNGase FA F5'-GATATTGTATACGGGACACCGG-3'326 R5'-CTCTGATTATTGATAGGGTTTGCTG-3'B F5'-TGCTTTTCCATAAGGGACACC-3405 R5'-ACATTTACGCTTCCGGCTGAT-3'PNGase F-Ⅱ F5'-TGCAGCCTTATTACAGGTGCTC-3'528 R5'-CCCATTAAATAAAGACTGATCGTCC-3'

1.2 方法

1.2.1NCBI中EM菌株PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因查找从美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)数据库中下载ElizabethkingiameningosepticumATCC 13253 (GCA_000401415.1)、ElizabethkingiameningosepticumNBRC 12535 (GCA_000367325.1)、Elizabethkingiameningosepticum502 (GCA_000447375.1)基因组序列文件，以FMS-007的全基因组序列作为模板，利用基本局部相似性比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)进行序列比对。然后，应用Sanger Center开发的ACT工具[21]进行基因组比对。基于基因组比对的位置对应关系，根据FMS-007基因组PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ位置定位另外3株菌株基因组中的PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因，并在NCBI网站进行在线BLAST验证。

1.2.2DNA提取应用天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组DNA抽提试剂盒提取EM基因组DNA，-20 ℃保存。抽提方法为DNA柱吸附洗脱法，按试剂盒说明书操作。

1.2.3PCR检测临床菌株PCR反应体系为50 μl，包括模板DNA(约50 ng/μl)1 μl、上游引物(10 μmol/L)2 μl、下游引物(10 μmol/L)2 μl、PrimeSTAR®Max DNA Polymerase(2×) 25 μl，用无菌去离子水补至50 μl。上述PCR反应引物包括16SrRNA基因、PNGaseF基因和PNGaseF-Ⅱ基因的引物。PCR反应程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 5 s，循环35次。每次实验均设阳性对照(SX7菌株和ATCC 13253菌株)和阴性对照(H2O、阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌临床分离株)。于PCR完成后，各取4 μl 16SrRNA基因、PNGaseF基因和PNGaseF-Ⅱ基因PCR产物混合，用于1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压设定为120 V，电泳时间为1 h，并在凝胶成像系统中将结果拍照留存。阳性扩增产物测序后，利用NCBI数据库中BLAST工具进行序列比对。16S rRNA比对结果用于菌株类别的确认。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件处理数据，配对计数资料比较采用配对χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NCBI中EM菌株PNGase基因的分布

除本实验室发表的FMS-007全基因组核酸序列外，在NCBI中检索到3株已发表全基因组核酸序列的EM，分别是EM (ATCC 13253)、EM (NBRC 12535)和EM (502)。根据FMS-007全基因组核酸序列中PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ的位置查找另3株菌株中是否也存在PNGase基因时发现，这4株菌株均携带PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ(表2)。其中FMS-007与502的PNGaseF核酸序列高度同源(100%)；ATCC 13253与NBRC 12535的PNGaseF核酸序列高度同源(100%)；FMS-007与ATCC 13253的PNGaseF核酸序列同源性为77%， 故将 FMS-007 和 ATCC 13253 菌株携带的PNGaseF分别命名为PNGaseF(A) 和PNGaseF(B)。以上4株EM菌株的PNGaseF-Ⅱ核酸序列同源性较好(81.8%～100%)。因此，检测EM临床分离株中PNGase基因时，分别针对PNGaseF(A) 和PNGaseF(B) 基因设计2对不同引物，利用PNGaseF-Ⅱ保守区设计1对引物(表1)。

表2NCBI中EM菌株PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ的携带情况

Tab.2DistributionofPNGaseFandPNGaseF-ⅡamongEMsinNCBI

StrainGenBank assembly IDPNGase FABPNGase F-ⅡElizabethkingia meningosepticum FMS-007CP006576+-+Elizabethkingia meningosepticum ATCC 13253GCA_000401415.1-++Elizabethkingia meningosepticum NBRC 12535GCA_000367325.1-++Elizabethkingia meningosepticum 502GCA_000447375.1+-+

2.2 EM临床分离株中PNGase基因的分布情况

于浙江省采集EM临床分离株65株，应用组合PCR检测16SrRNA、PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因。全部菌株16SrRNA基因扩增阳性(图1)，经测序并与NCBI数据库中序列对比，扩增产物片段大小与引物设计一致，且均是EM特异性的16SrRNA。

M, marker DL2000; 1, FMS-007; 2, ATCC 13253; 3-7, EM specimens; 8, H2O; 9,Enterobactercloacaespecimen.

图116SrRNA、PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ的PCR产物电泳

Fig.1ElectrophoresisofPCRproductsof16SrRNA(1500bp),andfragmentsofPNGaseF(326bpor405bp)andPNGaseF-Ⅱ (528bp)genes

65株EM临床分离株中，PNGaseF扩增阳性41株，其中PNGaseF(A) 基因片段扩增阳性33株、PNGaseF(B) 基因片段扩增阳性8株；PNGaseF-Ⅱ扩增阳性62株(表3)。PNGase基因阳性扩增产物经测序并与NCBI数据库中序列对比，产物大小与设计大小一致，且均是PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ特异性的。PNGase阳性菌64株，阳性率为98.5%；PNGaseF/PNGaseF-Ⅱ共阳性菌39株，共阳性率为60.0%；PNGaseF(A) 阳性菌33株，阳性率为50.8%；PNGaseF(B) 阳性菌8株，阳性率为12.3%；PNGaseF-Ⅱ阳性菌62株，阳性率为95.4%；PNGaseF-Ⅱ阳性率高于PNGaseF(配对χ2检验，P<0.01)(表4)。

表365株EM菌株中PNGase亚型分布

Tab.3DistributionofPNGaseamong65clinicalEMstrains

Subtype of PNGasePositive case (rate)Negative case (rate)PNGase F A33 (50.8%)24 (36.9%)B8 (12.3%)PNGase F-Ⅱ62 (95.4%)3 (4.6%)PNGase F/PNGase F-Ⅱ39 (60.0%)26 (40.0%)

表465株EM菌株中PNGaseF与PNGaseF-Ⅱ阳性率的比较

Tab.4ComparisonofPNGaseFandPNGaseF-Ⅱin65clinicalEMstrains

PNGase F-Ⅱ positivePNGase F-Ⅱ negativeTotalPNGase F positive39(60.0%)2(3.1%)41(63.1%)PNGase F negative23(35.4%)1(1.5%)24(36.9%)Total62(95.4%)3(4.6%)65(100%)

3 讨论

EM作为条件致病菌，其所致感染多为散发报道，未引起临床重视。但近年随着植入性医疗器械的广泛使用，EM感染在ICU中的发病率逐年升高；且因其具有天然耐多药的特性，给临床治疗带来困难[22]。因此，建立该菌快速检测方法有利于指导临床用药，对其特征性酶的分析有利于进一步深入研究。

EM具有非发酵，无动力，氧化酶、触媒、吲哚阳性等生化特征[23]，现有临床手段是根据以上生化特征来鉴定，但这种方法费时费力，不利于及时指导临床用药，因此有必要建立核酸检测方法。PNGase在真核生物中广泛存在，但在原核生物中PNGase F仅报道存在于EM中[15]，因此PNGase F可作为EM的特异性分子标记用于检测。本研究检测65株EM临床分离株，发现PNGase基因的携带率高达98.5%，提示将其作为EM检测的特异分子标记灵敏度高。其中，PNGaseF-Ⅱ的携带率(95.4%)高于PNGaseF(63.1%)，提示PNGaseF-Ⅱ作为分子标记检测EM的灵敏度高于PNGaseF，更适用于EM的核酸检测。根据现有公开的4株EM全基因组核酸序列比对PNGaseF基因，发现存在PNGaseF(A)和PNGaseF(B)，其序列同源性低于PNGaseF-Ⅱ，因此本研究设计的针对PNGaseF基因的引物可能只适用于PNGaseF(A)和PNGaseF(B)，不适用于其他未知亚型的PNGaseF，从而导致假阴性的存在。

根据PNGase对EM进行分型未见报道。本研究首次根据PNGase F和PNGase F-Ⅱ这2种同工酶将其分为4型：PNGase F和PNGase F-Ⅱ共阳性、PNGase F阳性但PNGase F-Ⅱ阴性、PNGase F阴性但PNGase F-Ⅱ阳性及PNGase F和PNGase F-Ⅱ共阴性。本研究显示，经16S rRNA确认过的65株EM中，以PNGase F和PNGase F-Ⅱ共阳性菌株为主，占60.0%；其次是PNGase F阴性但PNGase F-Ⅱ阳性亚型，占35.4%；其余2种亚型所占比例较低：PNGase F阳性但PNGase F-Ⅱ阴性菌株占3.1%，PNGase F和PNGase F-Ⅱ共阴性菌株占1.5%。不同亚型PNGase在EM中的生物学意义未知，但同时携带PNGase F和PNGase F-Ⅱ的菌株占60.0%，提示EM中这2个同工酶的存在非常重要，可能在细菌感染、代谢或抵抗外环境中起作用，值得深入研究。

本研究的不足之处在于对PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因进行PCR检测时仅以小样本(10株)阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌(数据未显示)作为阴性对照，初步判断其特异性，还需以金黄杆菌属内的产吲哚金黄杆菌、吲哚金黄杆菌、黏金黄杆菌、金矿金黄杆菌和大菱鲆金黄杆菌作为阴性对照，并对检测方法的特异度进行评价。其中产吲哚金黄杆菌的阴性对照最重要，因其临床分离菌株数占金黄杆菌属的42.9%[7]，与EM临床分离菌持平。本研究中的EM临床菌株全部来自浙江省，而不同地区来源的EM临床菌株中PNGase特征可能不同，这有待进一步研究。

综上所述，本研究建立了EM中PNGase检测和分型的方法，发现PNGase在EM中携带率高达98.5%，可作为分子标记用于EM检测。同时，EM以PNGase F和PNGase F-Ⅱ共阳性亚型为主，提示2个同工酶的存在可能具有重要的生物学意义，值得进一步研究。

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