扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白基因的克隆和表达

张振清，张爽，黄弋，张波，胡晓敏，袁志明

1. 中国科学院武汉病毒研究所农业与环境微生物重点实验室，武汉 430071； 2. 中国科学院大学，北京 100039； 3. 湖北大学，武汉 430062

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)是一种有包膜的负链RNA病毒，形态多样，包括杆状、丝状及“L”形。埃博拉病毒属丝状病毒科，有苏丹埃博拉病毒(Sudan Ebola virus，SUDV)、扎伊尔埃博拉病毒(Zaire Ebola virus，ZEBOV)、塔伊森林埃博拉病毒(Taï Forest Ebola virus, TAFV)(也称科特迪瓦埃博拉病毒，Cote d’Ivoire Ebola virus)、本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyo Ebola virus，BDBV)和雷斯顿埃博拉病毒(Reston Ebola virus，RESTV)5种亚型。EBOV 一般通过血液、体液和分泌液等传播，能引发灵长类动物出血热症状，人感染后病死率高达90%以上，目前还没有有效预防和治疗的药物和疫苗，被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)列为对人类危害最严重的生物安全四级病毒和潜在的生物战剂。该病毒首次于1976年在非洲报道，此后几十年一直在非洲大地零星暴发感染[1-3]。2014年3月以来，EBOV感染在几内亚、利比里亚、塞拉利昂、尼日利亚西非4国暴发和流行。根据WHO发布的疫情最新通报，截至8月20日，西非地区累计出现确诊、疑似和可能EBOV感染病例2 615例，1 427例死亡，已成为国际关注的突发公共卫生事件，并对其他国家的公共健康构成威胁。尽管到目前为止，EBOV疫情主要发生在非洲，但随着中国与非洲经济、文化联系的日益密切，大量人员频繁往来，该疫情将对中国的公共卫生体系建设和疫情防控带来严峻的挑战和威胁。为此，国家有关部门对此次疫情给予了高度关注，发布了EBOV防控的指导性文件，启动了相应的应急科技支撑项目开展EBOV预防和控制的研究。

EBOV的基因组为单股负链RNA，大小约19 kb，包裹在直径800～900 nm的核衣壳中[4]，基因顺序为3′-NP-VP35-VP40-GP/sGP-VP30-VP24-L-5′[5,6]。每种基因产物均由各自的mRNA所编码。包膜糖蛋白(glycoprotein，GP)基因形成2个读码框架，分别编码非结构分泌型糖蛋白(secretory glycoprotein，sGP)和全长跨膜GP。sGP作为早期产物大量生产和分泌，参与免疫逃避反应，然后通过RNA剪接机制合成全长GP。GP是病毒颗粒外表面突出的唯一结构蛋白，与细胞受体结合并介导病毒通过内吞作用进入宿主细胞。

GP作为EBOV的最主要结构蛋白，是最理想的诱导产生中和抗体的抗原。目前大多数有关EBOV抗体检测技术、特异性抗病毒疫苗和药物研究还停留在实验室阶段，难以用其活病毒和临床患者血清验证相关检测技术的有效性，也难以开展临床试验以评估研发的疫苗和药物。这些限制条件制约了EBOV检测和治疗技术的发展。为深入研究EBOV感染与致病机制，建立快速抗体检测技术，探讨蛋白结构与功能的关系，研制抗病毒血清和抗病毒药物，进行GP表达和纯化具有重要的现实意义。本研究利用获得的全长EBOVGP基因，进行了原核和真核表达，制备了多克隆抗体(简称多抗)，为下一步检测技术的建立和EBOV的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试剂、质粒、引物、菌株和细胞

Tris、异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)购自Sigma公司，甘油购自国药集团化学试剂有限公司，质粒提取试剂盒购自Omega公司，凝胶回收试剂盒购自Transgene公司，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记羊抗鼠多抗购自Promega公司，限制性内切酶购自TaKaRa公司和NEB公司。 ZEBOV GP(注：并非全长序列，全长序列只能在感染过程中通过RNA剪接形成，病毒基因组中只存在单一的剪接前GP基因)基因序列(NC_002549)由北京奥科生物技术有限公司合成。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)引物由上海英俊生物技术有限公司合成(表1)。质粒pET28a(+)、pGEX6p-1、pcDNA3.1(+)、pEGFP-N1和大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coil)JM109、HB101、BL21(DE3)、BL21(Rosseta)及BHK21细胞和HEK293T细胞由本实验保存。

1.2 EBOV GP基因的点突变

为在大肠埃希菌和真核细胞中表达全长成熟GP，在GP基因的885位核苷酸(nucleotide，nt)后加入1个碱基A。以EBOVGP基因为模板，分别用引物Primer1F/Primer2R和Primer1R/Primer2F进行PCR扩增，获得片段1和片段2。将获得的2个片段等摩尔量混合作为模板，利用引物Primer1F/Primer1R进行Overlap PCR，获得融合DNA片段，然后将其插入pMD18T-simple转化E.coilJM109，涂布在含有100 μg/ml氨苄西林的LB固体平板，筛选阳性克隆，经测序正确后命名为pMD18T-simple-edited GP。

表1所用引物

Tab.1Theprimersusedinthisstudy

引物序列(5'→3')功 能Primer1FGGAATTCATGGGGCGTTACAGGAATA扩增GP连入pET28aPrimer1RCCCAAGCTTCTAAAAGACAAATTTGCATATACAG扩增GP连入pET28aPrimer2FGAAACTAAAAAAAACCTCACTAGA点突变形成edited GPPrimer2RTCTAGTGAGGTTTTTTTTAGTTTC点突变形成edited GPPrimer3FCGGAATTCATCCCACTTGGAGTCATCCA扩增GP1(33^313 aa)连入pET28aPrimer3RCCCAAGCTTTTAGTTTGATACAACTGTGAAAGACAACT扩增GP1(33^313 aa)连入pET28aPrimer4FCGGAATTCAAGAAGGACTTCTTCAGCTCAC扩增GP1(190^313 aa)Primer4RCCCAAGCTTTTAGTTTGATACAACTGTGAAAGACAACT扩增GP1(190^313 aa)Primer5FCGGAATTCGAAGCAATTGTCAATGCTCAACC扩增GP2(502^632 aa)Primer5RCCCAAGCTTTTAATCAACAAAATCATGAATAATCTGATCAAT扩增GP2(502^632 aa)Primer6FCGCAAGCTTACCATGGGCGTTACAGGAATATTGC扩增edited GP连入pcDNA3.1(+)Primer6R-1CGGGTACCCTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCA- AAGAC扩增edited GP连入pcDNA3.1(+)Primer6R-2CTGAGATGAGTTTTTGTTCAAAGACAAATTTGCATATACAG- AATAAAGC扩增edited GP连入pcDNA3.1(+)Primer7FCGCAAGCTTACCATGGGCGTTACAGGAATATTGC扩增GP1连入pcDNA3.1(+)Primer7R-1CCGGTACCCTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTT扩增GP1连入pcDNA3.1(+)Primer7R-2CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTCTTCGAGTTC- TTCTCCC扩增GP1连入pcDNA3.1(+)Primer8FCCGAAGCTTACCATGGAAGCAATTGTCAATGCTCAACC扩增GP2连入pcDNA3.1(+)Primer8RCGGGTACCCTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTT- CAAAGACAAATTTGCATATACAGAATAAAGC扩增GP2连入pcDNA3.1(+)

1.3 EBOV GP原核及真核表达载体的构建

以pMD18T-simple-edited GP质粒为模板，用引物Primer1F/Primer1R(包含EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ)进行PCR扩增，获得的DNA片段连入pET28a(+)，转化E.coilJM109，涂布含有50 μg/ml卡那霉素的LB固体平板，筛选出阳性克隆pET28a(+)-sGP。同样，以pMD18T-simple-edited GP为模板，分别用引物Primer3F/Primer3R、Primer 4F/Primer 4R和Primer5F/Primer5R进行PCR扩增，获得相应目标片段，分别构建pET28a(+)-GP1(33～313 aa)、pET28a(+)-GP1(190～313 aa)和pET28a(+)-GP2(502～632 aa)重组质粒。所有构建的重组质粒通过酶切和测序进行鉴定。

以pMD18T-simple-edited GP为模板，利用引物Primer6F/Primer6R-1(包含酶切位点KpnⅠ和Hind Ⅲ、ACCATG真核表达标签和c-myc标签)进行PCR扩增，再以纯化扩增片段为模板，利用引物Primer6F/Primer6R-2进行PCR，将获得的产物连入pcDNA3.1(+)和pEGFP，转入E.coilJM109并涂布在含有100 μg/ml氨苄西林的LB固体平板，筛选出阳性克隆pcDNA3.1(+)-edited GP。同样，用引物Primer7F/Primer7R-1、Primer7F/Primer7R-2和Primer8F/Primer8R进行PCR扩增，获得目标片段，构建重组质粒pcDNA3.1(+)-GP1和pcDNA3.1 (+)-GP2。所有构建的重组质粒通过酶切和测序进行鉴定。

1.4 EBOV GP的原核表达与纯化及多抗制备

将重组质粒pET28a(+)-sGP、pET28a(+)-GP1(33～313 aa)、pET28a(+)-GP1(190～313 aa)、pET28a(+)-GP2(502～632 aa)转化E.coilBL21(DE3)。重组菌株分别在LB液体培养基中摇床培养(37 ℃，220 r/min)至600 nm处光密度(optical density，OD)值为0.4，添加IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，摇床培养过夜(16 ℃，120 r/min)。离心收集菌体(8 000 r/min，30 min)，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)检测上清液和沉淀物中目的蛋白表达情况，切下含目标蛋白的琼脂条备用。

收集的菌体经超声破碎后，离心收集包涵体(13 000 r/min，30 min)，经8 mol/L尿素溶解后，用Ni柱纯化，纯化蛋白在透析袋里﹝透析液：50 mmol/L Tris pH 7.9、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、50 mmol/L NaCl、10%甘油﹞，4 ℃磁力搅拌下缓慢复性。将含有目标蛋白的琼脂条和复性纯化GP1(33～313 aa)作为免疫原，分别免疫BLAB/c雌鼠，获得抗血清， -80 ℃保存。

1.5 EBOV GP的真核表达及鉴定

用脂质体LipofectionTM2000(Invitrogen公司)法和磷酸钙转染法，将重组质粒pcDNA3.1(+)-edited GP、pcDNA3.1(+)-GP1和pcDNA3.1(+)-GP2转染BHK21细胞和HEK293T细胞。转染24 h后收集细胞，用复性GP1(33～313 aa)制备的抗体经蛋白免疫印迹和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)检测目的蛋白。

1.6 酶联免疫吸附试验检测GP抗体效价

用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测GP 抗体效价。复性纯化的GP1(33～313 aa)用包被液(0.1 mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释成1 μg /ml，每孔加入100 μl，4 ℃ 过夜。将割胶纯化和变性复性纯化的GP1(33～313 aa)抗血清及用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)免疫的对照血清从1∶100开始用稀释液﹝含5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS， pH 7.4﹞倍比稀释。于450 nm波长处测OD值，630 nm为参考波长。抗体效价定义为：(实验孔OD450-空白孔OD450)与(阴性孔OD450-空白孔OD450)的比值(P/N)>2.1时的最大血清稀释倍数。

2 结果

2.1 EBOV GP的原核表达载体及真核表达载体的构建

EBOV GP是包膜糖蛋白，疏水性较强，在大肠埃希菌中易形成包涵体。成熟的GP在胞内切割为GP1和GP2，两者通过分子间二硫键连接在一起。根据GP的结构[7]，分别选取GP亲水性较强，暴露在空间结构表面的蛋白片段GP1(33～313 aa)、GP1(190～313 aa)、GP2(502～632 aa)及sGP，通过PCR获得编码不同GP片段的DNA序列，构建含不同片段的原核表达载体，双酶切鉴定和测序结果表明插入序列正确(图1A)。

同时，为研究GP在真核细胞中的表达，构建了pcDNA3.1(+)-edited GP、pcDNA3.1(+)-GP1、pcDNA3.1(+)-GP2、pEGFP-edited GP等真核表达载体，酶切鉴定结果见图1B。

2.2 EBOV GP的原核表达和纯化及抗血清制备

大肠埃希菌能以包涵体形式表达GP1(33～313 aa)、 GP1(190～313 aa)和sGP，而不能表达 GP2(502～632 aa)(图2A)。GP1(33～313 aa)包涵体经过变性和复性，获得可溶性蛋白，浓度为0.2 mg/ml(图2B)。用His tag单克隆抗体(简称单抗)对纯化的GP1(33～313 aa)进行蛋白免疫印迹验证(图2C)。对其他几种GP片段的诱导表达条件进行了优化，仍无法获得GP在大肠埃希菌中的可溶性表达。

用含有GP1(33～313 aa)的琼脂条和可溶性蛋白作为抗原免疫BALB/c雌鼠，获得与GP发生特异性结合反应的多抗。

ELISA结果显示，可溶性GP能诱导小鼠产生高效价的抗体，效价为1∶3 200；而用含GP的琼脂条获得的抗体效价只有1∶400(表2)。另外，用可溶性蛋白抗原制备的多抗可用于目标蛋白表达的检测。

表2ELISA检测血清GP抗体效价

Tab.2TitersofmouseantiseratoEBOVGPassessedbyELISA

免疫抗原小鼠血清稀释度1/1001/2001/4001/8001/1 6001/3 2001/6 400PBS (P/N)2.531.981.581.461.381.421.36GP(33^313 aa)割胶 (P/N)3.873.232.541.891.561.671.73GP(33^313 aa)复性 (P/N)5.324.874.133.672.982.342.09

A: pET28a(+)(enzyme digestion sites:EcoR Ⅰ andHind Ⅲ). B: pcDNA3.1(+)(enzyme digestion sites:KpnⅠ andHind Ⅲ).

图1EBOVGP表达载体的酶切鉴定

Fig.1RestrictiondigestionofplasmidsfortheprokaryoticandeukaryoticexpressionofEBOVGP

A: Expressions of GP1(33-313 aa), GP1(190-313 aa), GP2(502-632 aa) and sGP inE.coliBL21(DE3). Expression conditions: IPTG (0.2 mmol/L),OD(0.4), 16 ℃, 8 h, 150 r/min. B. Renaturation and purification of GP1(33-313 aa). C: Western blotting of purified GP1(33-313 aa) using His tag monoantibody. D: Western blotting of expressed GP inE.coliBL21 (DE3). M, marker; sedi, sediment; super, supernatant.

图2EBOVGP原核表达纯化及抗体检测

Fig.2ProkaryoticexpressionandpurificationofrecombinantEbolavirusGPandpreparationofGPantibody

2.3 EBOV GP的真核表达及鉴定

真核表达载体pcDNA3.1(+)-edited GP、pcDNA3.1(+)-GP1和pEGFP-edited GP转染BHK21和HEK293T细胞。荧光显微镜观察发现，2种细胞在转染pEGFP-edited GP后，大多数细胞能发绿色荧光(结果未列出)。蛋白免疫印迹结果显示，edited GP、GP1在HEK293T细胞中特异性表达。成熟的GP在胞内切割为GP1和GP2。myc-tag定位在GP2的C端，GP2相对分子质量较小(18 000)，所以myc抗体在edited GP相应位置没有出现目的条带(图3A)。因为BHK21细胞不含有与pcDNA3.1(+)SV40启动子结合的启动蛋白，所以没有检测到GP的表达。

用GP多抗和myc单抗进行IFA，结果显示HEK293T细胞能在细胞质中特异性表达edited GP和GP1，而在BHK21细胞中检测不到edited GP和GP1的表达(图3B)。

A: Western blotting of GP expression in HEK293T and BHK21 cells transfected with LipofectionTM2000. B: IFA detection of GP expression in HEK293T and BHK21 cells transfected 24 h later with edited GP and GP1. The secondary antibody was FITC-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody.

图3EBOVGP的真核表达

Fig.3ExpressionofEBOVGPinHEK293TandBHK21cells

3 讨论

GP为EBOV唯一的表面包膜蛋白，是最为理想的诱导宿主产生中和抗体的抗原。本研究利用获得的全长EBOVGP基因，探究了EBOV GP全长蛋白、GP1和GP2的原核和真核表达，获得了可溶性GP，制备了具有一定效价的GP多抗，为下一步EBOV特异性检测技术的建立及其研究奠定了基础。

EBOV GP在进化过程中形成了一个高效机制，依赖于特殊的复制酶转录后剪接机制[8,9]，有效解决了病毒基因组容量小但需多种蛋白参与病毒感染与复制的生命周期问题。GP基因共编码4种蛋白：sGP、edited GP、GP1和GP2。成熟的GP由GP1和GP2 亚单位形成三角裂杯状(three lobed chalice shape)的同源三聚体[10]，且高度糖基化。

EBOV GP是一种高度糖基化的膜蛋白，疏水性很强，不利于在原核中可溶性表达，易形成包涵体[11]。本研究通过尝试将GP1(33～313 aa)、GP1(190～313 aa)、GP2(502～632 aa)及剪接前的全长GP等在大肠埃希菌中表达，通过优化表达条件，包括 IPTG浓度(0.1～1 mmol/L)，温度(16 ℃、20℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃)，转速(90、120、150、220 r/min)，添助溶剂甘油、巯基乙醇，更换表达菌株E.coil(Rosseta)和载体pGEX6p-1(带GST标签)等，仍没有获得可溶性表达。因此，实现GP在大肠埃希菌中的可溶性表达还需进一步研究。

GP在EBOV感染和复制过程中起至关重要的作用。现有研究表明[12,13]，GP参与介导病毒侵入细胞过程，糖基化基团起关键作用。糖基化基团还为感染动物提供了很强的免疫原性，使机体产生中和抗体和T细胞反应。研究表明，EBOV GP能引起血管内皮细胞脱离，被认为是埃博拉出血热患者临床出血的重要原因[14]。市场上没有商品化EBOV GP抗体，本研究通过原核表达的包涵体变性、复性、纯化，获得免疫原，免疫小鼠后获得可靠的EBOV GP抗体，能满足后续的研究需求。

致谢

感谢蔡全信先生提供myc单克隆抗体及在实验技术上给予的支持。

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