眼镜蛇毒对成年大鼠脊神经节BDNF和c-jun表达的影响

周荣海，丁 见，熊克仁

(皖南医学院 人体解剖学教研室，安徽 芜湖 241002)

眼镜蛇毒是眼镜蛇毒腺分泌的毒液，具有血液毒性和神经毒性[1]。蛇毒可以改变周围和中枢神经系统正常的兴奋传递，从而影响正常的神经调节活动[2]。脊神经节是机体内、外环境与脊髓连结的纽带，接受外周初级感觉信息的传入进而将其传送到中枢。脑源性神经营养因子(brain derived neorotrop-hin factors,BDNF)是猪脑中分离出来的一种碱性蛋白，是神经营养因子家族中的一员，对神经元有维持和修复功能。即刻早基因(immediate early response genes,IEGs)c-jun是参与周围神经系统功能活动的调控基因之一，正常情况下表达非常少，但机体受到刺激时其表达会增多[3]。目前，尚未见有关眼镜蛇毒对脊神经节中BDNF和c-jun表达的报道。本实验通过免疫组织化学方法观察眼镜蛇毒对脊神经节BDNF和c-jun表达的影响，为探讨眼镜蛇毒中毒机制提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 蛇毒 眼镜蛇毒(干毒，由安徽省黄山市屯溪毒蛇养殖研究所提供)。

1.2 实验动物 实验用SD雄性大鼠24只(由皖南医学院实验动物中心提供)，体质量(250±15)g。

1.3 实验分组及方法 大鼠随机分为3个组，即正常对照组、生理盐水组和眼镜蛇毒组，每组8只大鼠。眼镜蛇毒组，将干粉状眼镜蛇毒与生理盐水按1∶3比例稀释后，于右大腿后外侧按0.5 μl/kg量注入；生理盐水组在同部位注入相同体积的生理盐水；正常对照组不作处理。仔细观察，若发现蛇毒组大鼠烦躁不安，呼吸急促伴啸鸣音等中毒症状特别明显时，立即腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)处死；同时处死另外两组大鼠。断头，取右侧第5腰神经节，包埋成蜡块后切片，厚5 μm，切片后脱蜡，依次进行下面的步骤：3%双氧水，室温10 min，热修复后冷却，PBS洗3次，每次5 min；正常小牛血清封闭37℃1 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加一抗BDNF(1∶150)、c-jun(1∶1 200)，冰箱4℃过夜，PBS洗3次，每次5 min；第2天生物素化羊抗兔IgG(1∶100)复温1 h，链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC 1∶100)液1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色。常规脱水、透明、中性树胶封片后，光镜下仔细观察分析片子。

1.4 神经元计数及灰度值测定 在高倍视野下(×400)计数脊神经节内BDNF和c-jun阳性神经细胞，用Image J图像分析软件测量细胞平均灰度值。

2 结果

正常组、生理盐水组及眼镜蛇毒组大鼠的右侧第5腰神经节都有BDNF和c-jun表达，BDNF和c-jun阳性细胞都呈棕黄色，主要为胞浆着色，着色都较均匀(见图1、2)，少量的细胞呈空泡样；多数为大型细胞，也有中、小型细胞，其中BDNF阳性神经元中大型细胞占总数70.7%，c-jun阳性神经元中大型细胞占总数72.2%。右侧第5腰神经节生理盐水组BDNF和c-jun平均灰度值和细胞数与正常对照组相比较均没有差异(P>0.05)；右侧第5腰神经节眼镜蛇毒组较正常对照组和生理盐水组平均灰度值显著降低(P<0.01)，细胞数明显升高(P<0.01，见表1)。

A：正常对照组；B：生理盐水组；C：眼镜蛇毒组图1 在大鼠脊神经节中BDNF表达的情况(HPF×400)Fig 1 Expression of BDNF in spinal ganglion of rats(HPF×400)

A：正常对照组；B：生理盐水组；C：眼镜蛇毒组图2 在大鼠脊神经节中c-jun表达的情况(HPF×400)Fig 2 Expression of c-jun in spinal ganglion of rats(HPF×400)

眼镜蛇毒组与生理盐水组和正常对照组比较：﹡P<0.01，生理盐水组和正常对照组比较：#P>0.05

3 讨论

脊神经节是脊神经传入第一级神经元胞体的位置，是机体内外环境与脊髓中枢联结的纽带，是多种神经肽的制造场所和输送站。通过脊神经节神经肽向中枢和外周端的输入和释放，从而调节和传递机体各种感觉信息。外周神经的损伤会影响神经肽的合成、输送和释放，进而影响脊神经节的功能。在形态学上，脊神经节神经元胞体直径大于35 μm 为大型细胞,25～35 μm 为中型细胞,小于25 μm 为小型细胞[4]。本研究中观察到的神经元主要为大型细胞，BDNF阳性神经元中大型细胞占总数70.7%，c-jun阳性神经元中大型细胞占总数72.2%，这与大型神经元主要在传递非伤害性感受和抑制伤害感受中起着重要作用相一致[5]。

在神经系统发生、发育过程中，BDNF能够促进神经细胞的增殖、生长和分化并维持其生理功能[6]。当坐骨神经切断后，背根神经节中BDNF表达增加[7]，Utley等在用BDNF注入胶原管治疗坐骨神经损伤的研究中发现，BDNF有明显的促神经再生作用[8]，对脊神经节损伤可能具有保护作用[9]。本实验蛇毒组BDNF的高表达，可能与眼镜蛇毒中毒后BDNF对脊神经节神经元的修复和保护有关。有研究表明汞中毒后大鼠脊髓及脊神经节内的胶质纤维酸性蛋白表达上调可加速BDNF的合成和分泌[10]，本实验蛇毒组脊神经节BDNF的表达显著上调是否与胶质纤维酸性蛋白表达水平上升有关，有待于进一步研究。

c-jun是即刻早基因之一，BDNF是c-jun的目的基因，即刻早基因可促进BDNF的表达[11]。脊神经节存在许多与伤害性刺激相关的神经活性物质[12]，如c-jun、c-fos等。c-jun在神经细胞信息传导中起着重要作用，普遍存在于神经系统中，在正常情况下表达较少。周围神经损伤后,神经元在发生变性和再生的过程中，伴随着神经递质的变化，这可能是神经细胞对伤害性刺激的反应。有报导表明眼镜蛇毒可显著上调大鼠海马CA1区c-fos和c-jun的表达[13]，在坐骨神经病变情况下，腰4和腰5脊神经节在所有损坏的感觉神经元中c-jun有大量的表达[14]，说明c-jun可能与神经损伤有关。本研究发现眼镜蛇毒组比正常对照组、生理盐水组大鼠脊神经节c-jun表达明显增强，这可能是机体对中毒后的一种伤害性刺激性反应。在周围或中枢神经系统受到伤害性刺激后，神经细胞出现再生反应，并伴随c-jun基因表达上调，提示c-jun在抑制神经细胞凋亡、促进受损细胞修复以及改善神经细胞的存活等方面发挥重要作用[15]。因此，本实验中眼镜蛇毒组脊神经节c-jun表达的增强，可能是机体对蛇毒所致神经细胞损伤的保护机制之一。

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