TAP-1、TAP-2及HLA-I在鼻咽癌中的表达及临床意义

任艳鑫，李晓江，张丽娟，杨 洁，孙瑞梅，张世文，张 吉

(昆明医科大学第三附属医院：1. 头颈肿瘤研究中心；2. 病理科，云南昆明 650118)

鼻咽癌是中国南方及东南亚地区常见恶性肿瘤之一，其发病与EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染密切相关[1-2]。然而，仅仅感染EBV还不足以导致细胞癌变，机体的某些因素也起着重要的作用，细胞介导的免疫反应是机体清除恶性细胞的主要机制。TAP主要功能是与低分子多肽复合物-2、7(1ow molecular mass polypeptide, LMP-2、7)一起加工、转运内源性抗原肽(其中包括肿瘤抗原)至内质网，在内质网锚定的MHC(主要是HLA-I)结合抗原肽后将其呈递至细胞表面供CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)识别，从而启动细胞免疫。细胞免疫在机体抗肿瘤免疫中具有重要作用。HLA-I类分子肿瘤抗原可组成T细胞激活的第一信号，激活HLA特异性CD8+CTL，发挥抗肿瘤免疫效应。研究发现，在小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、头颈恶性肿瘤及脑恶性肿瘤中都发现TAP-1、LMP-2/7及HLA-1的缺失或下调，转染TAP-1后可诱导LMP-2/7及HLA-I表达的增加[3-6]。本文着重研究鼻咽部组织中TAP-1、TAP-2及HLA-I的表达及其对鼻咽癌患者免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验标本选取2000年1月至2002年12月我院病理科存档的蜡块标本共78例(均为活检和手术切除的标本)，其中包括鼻咽部非特异性炎症组织20例(入选对照组者均为患者自感不适，经本人及家属同意在我院行鼻咽部取材，病理检查排除)，鼻咽癌标本58例(患者临床资料见表1)。所有标本经免疫组化证实且为治疗前收集，血液标本每人取外周血2 mL，肝素抗凝，所有标本采集之前均经患者同意。所有鼻咽癌患者在病理确诊后根据NCCN指南(头颈部肿瘤临床实践指南)进行治疗。Ⅰ期患者接受根治性放疗，Ⅱ期+Ⅲ期及无远处转移的Ⅳ期患者接受TPU化疗4～6周期以及根治性放疗，有远处转移的Ⅳ期患者接受TPU化疗6周期以及姑息性放疗，患者均接受定期随访。

表1鼻咽癌患者的临床特征

Tab.1 Clinical characteristics of the NPC patients

参 数例数(%) 性别 男38(65.5) 女20(34.5)年龄(岁)49.23(14～84)临床分期 Ⅰ4(6.9) Ⅱ18(31.0) Ⅲ10(17.3) Ⅳ26(44.8)病理类型 高或中分化5(8.6) 未分化53(91.4)淋巴结转移 N017(29.3) N1～341(70.7)远处器官转移 M048(82.8) M110(17.2)

1.2实验试剂兔抗人HLA-I多克隆抗体购自美国Epitomics公司，兔抗人TAP-1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗人TAP-2单克隆抗体购自香港Abcam公司，IL-10酶联免疫检测试剂盒购自美国Biosource公司，SP免疫组化通用试剂盒购自北京中山公司，PE标记的鼠抗人CD8，FITC标记的鼠抗人CD4抗体，PC5标记的鼠抗人CD45抗体，同型对照分别为PE标记的鼠抗人IgG免疫球蛋白，FITC标记的鼠抗人IgG免疫球蛋白试剂均为Beckman Coulter公司提供。

1.3免疫组织化学方法将中性甲醛固定、石蜡包埋的鼻咽部组织标本制成4 μm厚的切片，采用SP免疫组化染色。用购自北京中杉公司的阳性对照片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。主要步骤：①石蜡切片脱蜡到水。②微波抗原修复。③30 mL/L H2O2-甲醇溶液浸泡10 min。④加100 mL/L山羊血清置室温20 min。⑤加一抗工作液4 ℃孵育过夜。⑥加生物素化二抗工作液，37 ℃孵育10 min。⑦加HRP标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育10 min。⑧DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固。

1.4结果判定TAP-1、TAP-2阳性染色为棕黄色，阳性信号主要位于细胞胞质。HLA-I类抗原阳性染色为棕黄色，阳性信号主要位于细胞胞质及细胞膜。综合染色反应强度和阳性细胞数量两个方面进行半定量记分法判定：按阳性着色程度评分，0分为无色；1分为浅黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。按阳性细胞比例评分，0分<5%；1分为5%～10%；2分为11%～50%；3分为51%～80%；4分为>80%。两者乘积判定阳性结果：0分为阴性(-)；1～4分为弱阳性(+)；5～8分为中度阳性()；9～12分为强阳性()。

1.5流式细胞术检测外周血T细胞比例取全血100 μL，加三色荧光抗体10 μL，阴性对照相同，避光室温静置20 min，用Q-prep自动溶血，30 min后上机检测，分析外周血及组织中CD4+T、CD8+T细胞，CD45+细胞为淋巴细胞，分别计算CD4+T、CD8+T细胞在淋巴细胞中的比值。

1.6ELISA法检测外周血中IL-10水平外周血收集后于离心机3 000 r/min离心25 min，收集上清液，再用包被缓冲液稀释为1∶400备用。按照试剂盒操作步骤进行。

1.7统计学分析采用SPSS 12.0统计软件进行处理，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，生存率用Kaplan-Meier法计算，显著性检验采用Log-rank法检验，预后进行单因素分析、多因素Logistic回归模型分析，当P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1鼻咽癌组织中TAP-1、TAP-2及HLA-I低表达TAP-1、TAP-2主要在细胞胞质中分布，在鼻咽正常组织中呈中度阳性或强阳性表达，阳性率分别为90%、95%(18/20、19/20)，表现为棕黄色或棕褐色。在鼻咽癌组织中大部分呈阴性或弱阳性43.1%、46.55%(25/58、27/58)(图1)。HLA-I主要在细胞胞质及胞膜上分布，在鼻咽正常组织中呈中度阳性或强阳性表达，阳性率为95%(19/20)，表现为棕黄色或棕褐色。在鼻咽癌组织中大部分呈阴性或弱阳性，阳性率为50%(29/58)(图1、表2)。

图1TAP-1，TAP-2及HLA-I在鼻咽癌及鼻咽正常组织中的表达

Fig.1 Expressions of TAP-1, TAP-2 and HLA-I in NPC and normal nasopharyngeal tissue

A、C、E：分别为TAP-1、TAP-2、HLA-I在鼻咽癌组织中低表达或无表达(×400)；B、D、F：分别为TAP-1、TAP-2、HLA-I在鼻咽正常组织中高表达(×400)。

表2鼻咽部不同病变组织中TAP-1、TAP-2及HLA-I的表达

Tab.2 Expressions of TAP-1 and 2 and HLA-I in NPC and control groups

组 别例数TAP-1表达*阴性阳性TAP-2表达*阴性阳性HLA-I表达*阴性阳性慢性炎症组20218119119鼻咽癌组58332531272929

两组比较，*P<0.01。

2.2鼻咽癌外周血中CD4+T、CD8+T细胞及IL-10的变化我们采用流式细胞术检测鼻咽癌组及对照组外周血中CD4+、CD8+T细胞及IL-10。鼻咽癌组CD4+T细胞有不同程度降低，明显低于对照组[(33.41±10.04)%vs. (40.15±3.56)%](P<0.05)，而CD8+T细胞略有升高，与对照组比较差异无统计学意义[(25.32±8.29)%vs.(22.89±2.24)%](P>0.05)。鼻咽癌IL-10表达明显高于对照组[(13.12±1.23)ng/mLvs.(3.69±1.03)ng/mL](P<0.05，图2)。

图2鼻咽癌组及对照组外周血中CD4+、CD8+T细胞的比例

Fig.2 The percentages of CD4+T cells and CD8+T cells in peripheral blood lymphocytes in NPC and control groups

A：CD4+T细胞在鼻咽癌患者外周血中比例为33.0%；B：CD4+T细胞在对照组外周血中比例为42.4 %；C：CD8+T细胞在鼻咽癌患者外周血中比例为25.2%；D：CD8+T细胞在对照组外周血中比例为22.4%。

2.3鼻咽癌中TAP-1、TAP-2及HLA-I与临床因素的关系在58例鼻咽癌中，我们发现TAP-1、TAP-2及HLA-I表达与年龄、性别无相关性(P>0.05)，而与TNM分期、有无淋巴结转移及有无远处转移密切相关(P<0.05，表3)。

表3鼻咽癌组织中TAP-1、TAP-2和HLA-I与临床参数的关系

Tab.3 Association of TAP-1, TAP-2 and HLA-I expressions with clinical factors in NPC

参 数TAP-1阳性阴性PTAP-2阳性阴性PHLA-I阳性阴性P年龄(岁) ≤4312(48%)16(48.5%)1.00015(55.5%)13(41.9%)0.43010(34.5%)18(62.1%)0.065 >4313(52%)17(51.5%)12(44.4%)18(58.1%)19(65.5%)11(37.9%)性别 男17(68%)21(63.6%)0.78616(59.3%)22(71%)0.41320(69%)18(62.1%)0.783 女8(32%)12(36.4%)11(40.7%)9(29%)9(31%)11(37.9%)TNM分期 Ⅰ+Ⅱ13(52%)7(21.2%)0.01515(55.6%)5(16.1%)0.00215(51.7%)5(17.2%)0.012 Ⅲ+Ⅳ12(48%)26(78.8%)12(44.4%)26(83.9%)14(48.3%)24(82.8%)颈淋巴结转移 有11(44%)30(90.9%)0.00012(44.4%)29(93.5%)0.00013(44.8%)28(96.6%)0.000 无14(56%)3(9.1%)15(55.6%)2(6.5%)16(55.2%)1(3.4%)远处转移 有1(4%)9(27.3%)0.0331(3.7%)9(29%)0.0140(0%)10(35.7%)0.000 无24(96%)24(72.7%)26(96.3%)22(71%)29(100%)19(64.3%)

2.4鼻咽癌中TAP-1、TAP-2及HLA-I表达与CD4+T、CD8+T细胞及IL-10的关系为了明确TAP-1、TAP-2及HLA-I表达是否对CD4+T细胞、CD8+T细胞及IL-10表达具有影响，我们分别将58例鼻咽癌患者分为TAP-1阳性组和阴性组，TAP-2阳性组和阴性组，HLA-I阳性组和阴性组，分析3种不同组别中CD4+T细胞、CD8+T细胞及IL-10表达的不同。CD4+T细胞在TAP-1、TAP-2、HLA-I阳性组与阴性组中表达差异无统计学意义(33.19±9.2vs. 33.35±8.05；33.58±6.4vs. 32.52±5.2； 34.34±6.58vs. 30.22±3.49；P>0.05)。CD8+T细胞在TAP-1、TAP-2、HLA-I阳性组均高于阴性组，差异具有统计学意义(27.93±4.04vs. 18.43±2.37；28.47±3.62vs. 19.18±2.11；31.35±4.72vs. 16.65±2.07；P<0.05)。IL-10在TAP-1、TAP-2、HLA-I阳性组均低于阴性组，差异具有统计学意义(9.87±1.24vs. 16.20±1.48；8.93±0.56vs. 16.04±1.75；6.28±0.86vs. 17.99±2.01；P<0.05，表4)。

表4鼻咽癌患者TAP-1、TAP-2、HLA-I表达与CD4+T、CD8+T细胞、IL-10的表达的关系

Tab.4 Analysis of CD4+T cells, CD8+T cells and IL-10 expression in different TAP-1, TAP-2, HLA-I expression groups in NPC

项目TAP-1阳性阴性PTAP-2阳性阴性PHLA-I阳性阴性PCD4+细胞(%)33.19±9.233.35±8.050.97033.58±6.432.52±5.20.81534.34±6.5830.22±3.490.379CD8+细胞(%)27.93±4.0418.43±2.370.01328.47±3.6219.18±2.110.01831.35±4.7216.65±2.070.005IL-10(ng/mL)9.87±1.2416.20±1.480.0218.93±0.5616.04±1.750.0156.28±0.8617.99±2.010.008

2.5影响鼻咽癌患者预后的单因素分析58例患者均按照NCCN指南进行规范化治疗并定期随访，将可能影响鼻咽癌治疗后进展的因素进行单因素Kaplan-Meier分析，列入的相关因素包括：年龄、性别、临床分期、有无淋巴结转移、有无远处器官转移、病理分型、TAP-1表达、TAP-2表达和HLA-I表达。我们发现临床分期、有无淋巴结转移、有无远处器官转移、病理分型、TAP-1表达、TAP-2表达及HLA-I表达与鼻咽癌患者预后相关，差异具有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 鼻咽癌单因素Kaplan-Meier分析图Fig.3 Kaplan-Meier curve for survival by different clinicopathologic factorsA:Ⅰ+Ⅱ期鼻咽癌患者生存率显著高于Ⅲ+Ⅳ期患者(56.25% vs. 38.89%, P<0.01);B:无淋巴结转移的鼻咽癌患者生存率明显高于有淋巴结转移患者(47.06% vs. 43.90%, P<0.05);C:无远处器官转移的鼻咽癌患者生存率明显高于有远处器官转移患者(54.35% vs 8.33%, P<0.01);D:低分化或未分化鳞癌的鼻咽癌患者生存率明显高于中、高分化鳞癌患者(49.06% vs. 0%, P<0.05);E: TAP-1表达阳性鼻咽癌患者生存率明显高于表达阴性患者(60.0% vs. 33.33%, P<0.01);F:TAP-2表达阳性鼻咽癌患者生存率明显高于表达阴性患者(62.96% vs.29.03%, P<0.01);G:HLA-I表达阳性鼻咽癌患者生存率明显高于表达阴性患者(65.52% vs. 24.14%, P<0.01)。

2.6鼻咽癌患者预后的多因素Logistic回归模型分析我们进一步将鼻咽癌患者多种因素(包括年龄、性别、临床分期、有无淋巴结转移、有无远处器官转移、病理分型、TAP-1表达、TAP-2表达、HLA-I表达)纳入Logistic回归模型分析。结果显示，只有有无远处器官转移及HLA-I表达为鼻咽癌患者独立预后因素(P=0.043，P=0.045，表5)。

表5鼻咽癌患者多因素Cox回归模型分析

Tab.5 Multivariate Cox regression analysis of NPC

因素BSEWaldPExp(B)95.0%CI for Exp(B)年龄-0.2550.3300.5950.4400.7750.406～1.481性别-0.0370.3050.0140.9040.9640.530～1.753TNM分期0.0490.7490.0040.9481.0500.242～4.555淋巴结转移-0.1440.4310.1120.7370.8660.372～2.013远处器官转移-0.8790.4634.5980.043*0.4150.167～1.030病理0.0810.6420.0160.8991.0850.308～3.814TAP-10.0680.9450.0050.9420.9340.147～5.949TAP-20.6551.0210.4120.5210.5190.070～3.844HLA-I0.5800.7774.5570.045*0.5600.122～2.568

3 讨 论

抗原处理相关转运体是MHC-I类分子抗原递呈途径中的重要分子。其主要功能是与低分子多肽复合物-2、7(1ow molecular mass polypeptide, LMP-2、7)一起加工、转运内源性抗原肽(其中包括肿瘤抗原)至内质网，在内质网锚定的MHC(主要是HLA-1)结合抗原肽后将其呈递至细胞表面供CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)识别，从而启动细胞免疫。由于MHC-I类基因、TAP基因、LMP-2及LMP-7基因位置靠近，转录活性同时受干扰素的诱导，能够协调三者基因产物的量，有效提呈抗原，故三者构成的系统被比喻成真核生物MHC-I类分子抗原加工和提呈的“操纵子”。 在肿瘤免疫应答过程中，MHC-I类分子限制的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)在阻止肿瘤的发生、发展过程中起关键作用。MHC-I类分子抗原加工和提呈的“操纵子”的任何组分的改变对肿瘤免疫应答第一信号的产生有直接影响。这些分子的减少或丢失可能反映了肿瘤细胞在MHC-I类分子向T细胞递呈免疫源性多肽这一作用而选择的一种逃避机制。

TAP-1启动子是593 bp的双向启动子，包含IFN-r反应元件、p53反应元件和NF-κB结合位点。其中任何异常调节反应元件及影响NF-κB的因素都可以引起TAP基因的表达异常，从而影响抗原加工和提呈的“操纵子”，最终引起肿瘤细胞表面抗原的表达异常。如果肿瘤细胞表面的TAP蛋白表达下降，将会导致肿瘤细胞的MHC-I类分子的表达下降或缺如[7-10]，结果是肿瘤不呈现或仅呈现弱的抗原性，导致肿瘤抗原无法被递呈给CD8+的T细胞，从而逃脱免疫监管，这是肿瘤免疫逃逸的一个重要机制。

本文鼻咽癌组织中TAP-1、TAP-2及HLA-I阳性表达分别43.1%、46.55%、50%，均显著低于鼻咽正常组织中的表达。这提示鼻咽癌患者对肿瘤抗原提呈功能减弱，肿瘤细胞很可能发生免疫逃逸。我们进一步检测鼻咽癌患者的CD4+T、CD8+T细胞及IL-10的表达变化。具有免疫抑制作用的IL-10表达增加，CD4+T细胞明显减少，而CD8+T细胞无明显差异。但是， TAP-1、TAP-2、HLA-I表达阳性鼻咽癌中CD8+T细胞表达升高，而IL-10表达减少。这提示TAP-1、TAP-2、HLA-I表达与肿瘤免疫密切相关，鼻咽癌TAP-1、TAP-2、HLA-I的下调，将抑制具有细胞毒性T淋巴细胞(CD8+T细胞)的数量，同时具有免疫抑制作用的IL-10分泌增加也将加剧细胞免疫功能的下降，这将为鼻咽癌细胞逃脱机体免疫监视创造条件。

我们发现临床分期、有无淋巴结转移、有无远处器官转移、病理分型、TAP-1表达、TAP-2表达、HLA-I表达与鼻咽癌患者预后相关。将这7项引入logistic模型，显示远处转移、HLA-I表达是鼻咽癌独立预后因素。HLA-I分子表达下调导致鼻咽癌患者生存率下降，这与其他研究者结果相一致[11-15]。提示HLA-I分子参与的肿瘤细胞免疫发挥着关键性作用， HLA-I分子表达下调或缺失将预示着患者的预后不良。

本研究提示我们在临床治疗中检测HLA-I分子的表达将可能作为鼻咽癌预后不良因素的指标之一。HLA-I分子低表达的鼻咽癌患者预示着将接受更加有力的治疗方案。同时，可以提高患者HLA-I分子表达的生物治疗也可作为该类患者的治疗选择。

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