MicroRNA-338-3p真核表达载体的构建及其对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响

郭 波，王文静，赵正豪，赵凌宇，汪鲁敏，胡丽丽，宋土生，黄 辰,3

(西安交通大学医学院：1.遗传学与分子生物学系；2.第一附属医院肝胆外科； 3.心血管研究中心，陕西西安 710061)

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类进化上高度保守的单链非编码RNA小分子，是LEE等[1]于1993年在秀丽小杆线虫的研究中发现的，其长度约为21～25 nt，广泛存在于真核生物中，大部分由基因的内含子部位剪切产生。目前的研究表明，miRNA分子通过两种[2-3]不同机制调节蛋白的表达，当miRNA和编码蛋白质的mRNA几乎完全配对时，miRNA诱导mRNA降解，这种miRNA介导的基因沉默机制在植物中比较普遍；当miRNA和编码蛋白质的mRNA不完全配对时，miRNA通过不完全的碱基配对结合mRNA的3’UTR，在转录水平上抑制基因翻译，从而调节细胞增殖[4]、周期[5]、侵袭转移[6]及凋亡[7]，参与机体的发育、代谢以及肿瘤的发生、发展等生物学过程。近期的研究结果表明，miR-338-3p在肝癌中能通过抑制SMO的表达而阻止肝癌细胞的迁移，提示miR-338-3p在肿瘤的发生过程中可能扮演类似抑癌基因的作用[8]。因此，本实验拟采用真核表达质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR，构建miR-338-3p的特异性过表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p，并鉴定其在人胃癌SGC-7901细胞系中的表达活性与效率，探究miR-338-3p对SGC-7901细胞系增殖能力的影响，为后期深入研究miR-338-3p在胃癌发生发展中的作用机制及基于miR-338-3p的基因靶向治疗策略研究提供前期实验基础。

1 材料与方法

1.1质粒、菌株和试剂质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR购自Invitrogen公司；Top10菌株为本实验室保存；氨苄青霉素(新泰生物公司)；限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ及T4DNA连接酶(TaKaRa公司)；DNA凝胶回收试剂盒、无内毒素质粒提取试剂盒(Omega公司)；RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司)。

1.2miR-338-3p寡聚核苷酸合成通过生物信息学方法在miRbase查找miRNA-338-3p成熟体序列并在两端构建HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点。Top oligo5′-AATTCTCTCCAACAATATCCTGGTGCTGA-GTGATGACTCAGGCGACTCCAGCATCAGTG-ATTTTGTTGAAGAA-3′；Bottom oligo 5′-AGCTTTCTTCAACAAAATCACTGATGCTGGAGTCG-CCTGAGTCATCACTCAGCACCAGGATATTGT-TGGAGAG-3′，序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3载体构建与鉴定真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切后片段，回收产物与退火成双链的miR-338-3p DNA序列在T4DNA连接酶作用下于16 ℃连接过夜；将连接产物转化入Top10感受态大肠杆菌，利用Amp抗性对重组子进行筛选培养12 h，挑取阳性单克隆菌落，于LB(Amp+)液体培养基摇床培养14h后送上海生工生物公司进行DNA测序。

1.4细胞培养与转染人胃癌SGC-7901细胞系培养于含PS和胎牛血清FBS(Gibco公司)的DMEM(PAA公司)培养基中，并置于37 ℃的CO2孵育箱中，2～3 d换液，取对数生长期的细胞进行实验；设pcDNATM6.2空载体组为对照，实验组按X-tremeGENE_HP_DNA_Transfection_Reagent(Roche公司)转染试剂说明书瞬时转染pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p表达载体的无内毒素质粒。

1.5Real-timePCR检测miR-338-3p在瞬转细胞系中的表达Trizol提取SGC-7901细胞总RNA；逆转录试剂盒PrimeScript®RT reagent kit和Real time PCR试剂盒SYBR®Premix ExTaqTMⅡ(Perfect Real Time)均购自TaKaRa公司；PCR反应引物序列：RT-primer：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCG-TGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCA-ACAAA-3′；Forward primer：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′；Reverse primer：5′-TGCTTCCAGCATCAGTGAT-3′；逆转录反应体系及条件：500 ng RNA，2 μL 5×PrimeScript®Buffer，0.5 μL PrimeScript®RT Enzyme Mix I，4.5 μL Rnase free water和1 μL stem loop RT primers，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；Real-time PCR反应体系及条件：逆转录产物1 μL，10 μL 2×SYBR Premix ExTaqⅡ，7 μL Rnase free water，1 μL Forward primer和1 μL Reverse primer，95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

1.6MTT实验调整细胞密度接种于96孔板，每组设置3个复孔，置于细胞培养箱中培养，24 h后转染质粒，利用MTT在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，由淡黄色被还原成蓝紫色或蓝黑色的MTT-甲肷，分别在第24、48、72 h取出细胞加入MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5二苯基四氮唑嗅盐]液，37 ℃孵育4 h后加入DMSO，利用酶标仪测定490 nm处各孔吸光度(A)值，以反映细胞数目并绘制细胞生长曲线。

2 结 果

2.1pcDNATM-GW/EmGEP-miR-338-3p表达载体的构建人工合成的miR-338-3p DNA单链退火为双链，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见70 bp大小目的条带(图1A)；LB液体培养基扩增pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体菌株，提取质粒后用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收大片段，可见5 000 bp左右大小目的条带(图1B)。

图1miR-338-3pDNAoligo退火及pcDNATM6.2的双酶切

Fig.1 The product of miR-338-3p DNA oligo and pcDNA 6.2 by enzyme digestion

A：miR-338-3p人工合成DNA oligo退火产物电泳图；B：pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后电泳图。M：Marker。

2.2pcDNATM-GW/EmGEP-miR-338-3p表达载体的鉴定将LB(Amp+)抗体筛选的阳性单克隆扩增培养后测序，与miR-338-3p DNA oligo序列进行Blast比对可见完全匹配(图2A)；构建成功的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p的表达图谱(图2B)。

2.3SGC-7901细胞瞬时转染及实时荧光定量PCR将构建成功的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p表达载体瞬时转染人胃癌细胞系SGC-7901，Real-time PCR检测转染后miR-338-3p的表达量，结果显示(图3)，与对照组相比，实验组中miR-338-3p的表达水平显著增加(P<0.05)。

2.4过表达miR-338-3p抑制SGC-7901胃癌细胞的增殖转染pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p表达载体后检测miR-338-3p对细胞增殖能力的影响，MTT结果显示(图4)，48 h后实验组中SGC-7901细胞的增殖有明显降低(P<0.05)，提示miR-338-3p可抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖。

3 讨 论

MiRNA可通过与mRNA匹配在转录后水平抑制基因翻译，导致其靶基因的蛋白表达水平下调，进而调节细胞多种生命活动[9]。一方面，miRNA在肿瘤的发生发展中具有原癌基因的作用，细胞的增殖研究发现miR-106b在前列腺癌、胃癌、食管癌、直肠癌等多种肿瘤中表达上调，提示其可能为一种原癌基因[10]。PETROCCA等[11]发现miR-106b可负调节E2F1基因的表达，研究发现高水平的E2F1可促进细胞凋亡，被miR-106b负调节的E2F1可反式激活多种基因促进细胞G1/S转换；另一方面，miRNA又可以抑制恶性肿瘤的发生，MOTT等[4]发现在33%的人胆管癌保本和胆管癌细胞系KMCH中miR-29b表达下调，通过在KMCH细胞中过表达miR-29b可促进其Mcl-1蛋白的表达。Mcl-1基因是一种凋亡相关癌基因，其可通过抑制bax基因的表达促进细胞凋亡。提示miR-29b可作为胆管癌治疗的靶分子。

图2pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR-338-3p表达载体的测序鉴定结果

Fig.2 The identification of pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR-338-3p expression vector by sequencing

A：pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p表达载体与目的miR-338-3p序列blast比对结果及测序结果；B：将miR-338-3p的DNA序列插入到编辑区域成功构建的pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR-338-3p表达载体的图谱。

图3pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p转染SGC-7901细胞表达水平

Fig.3 The expression level in SGC-7901 cells after transfected with pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p

*P<0.05。

图4MTT法检测miR-338-3p对SGC-7901细胞增殖的影响

Fig.4 The effect of miR-338-3p on the proliferation of SGC-7901 cells detected by MTT

*P<0.05。

MiRNA-338位于第17号染色体上，在不同物种间高度保守，由凋亡相关酪氨酸激酶(AATK)第七个内含子编码剪切为成熟的miRNA序列miR-338-3p和miR-338-5p，继而在细胞生长过程中发挥重要作用[12]。近来的研究显示，miR-338-3p在包括胃癌等[13]多种恶性肿瘤中均存在异常表达，如在肝癌、恶性黑色素瘤[14]等肿瘤中的表达量受到抑制，而在口腔癌中却呈现高表达趋势[15]，HUANG等[8]的报道证明miR-338-3p可通过抑制SMO而阻止肝癌细胞的迁移。同时，ZHANG等[16]的研究应用鸢尾黄酮抑制肺成纤维细胞生长，可以诱导miR-338-3p的表达上调，继而抑制了miR-338-3p靶基因LPA1的表达。这些研究均提示，miR-338-3p在恶性肿瘤的发生过程中可能起到了重要的调控作用。

MiRNA在机体细胞内主要通过Ⅲ型启动子来完成转录表达[17]，人为手段通过外源性miRNA干预细胞内的miRNA表达水平是目前研究miRNA生物学功能的主要手段，包括腺病毒和慢病毒表达载体以及人工化学合成miRNA的模拟物(mimics)在内的多种方法均能够在细胞内特异性的过表达某种特定的miRNA，而其中miRNA质粒真核表达载体的构建因其具有价格低廉、方法简便，能够模拟内源性miRNA前体的剪切过程等优点仍得到了广泛的应用。pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR是一种真核表达的特异性表达质粒，可通过转录提高细胞内特异性miRNA的表达水平，同时表达绿色荧光蛋白有利于鉴定转染效率。

在本研究中，我们以pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体为基础，经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切和纯化后与人工合成miR-338-3p的寡聚核苷酸进行连接，转化至E.coliTop10后，经过DNA测序、BLAST检测及验证，结果表明我们成功构建了miR-338-3p特异性表达载体；将构建成功的无内毒素质粒转染入SGC-7901细胞中，24 h通过Real time PCR发现转染了pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p特异性表达载体后的SGC-7901实验组中miR-338-3p的表达量显著高于对照组；重要的是通过MTT实验，我们发现高表达miR-338-3p的实验组中SGC-7901细胞的增殖能力受到显著抑制，提示miR-338-3p可以抑制肿瘤细胞的增殖，发挥类似抑癌基因的功能，利用真核表达载体外源性表达miR-338-3p能够成为有效抑制胃癌细胞生长的重要手段，并为后期深入研究其在胃癌发生发展中的作用机制奠定了基础。

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