斑马鱼对3种氯酚的富集作用及其SOD酶活性应激反应研究

宋志慧，孙欣欣，李捍东

1.环境基准与风险评估国家重点实验室，中国环境科学研究院，北京 100012

2.青岛科技大学环境与安全工程学院，山东青岛 266042

斑马鱼对3种氯酚的富集作用及其SOD酶活性应激反应研究

宋志慧1，2，孙欣欣2，李捍东1*

1.环境基准与风险评估国家重点实验室，中国环境科学研究院，北京 100012

2.青岛科技大学环境与安全工程学院，山东青岛 266042

为了研究对氯酚（4-CP）、2，4-二氯酚（2，4-DCP）、2，4，6-三氯酚（2，4，6-TCP）对斑马鱼的生理毒性作用，以7 d富集系数（KBCF）和超氧化物歧化酶（SOD）活性为评价指标，采用半静态试验法对斑马鱼进行驯养和试验，测定斑马鱼对3种氯酚的7 d KBCF，同时测定不同浓度条件下，暴露1 d和7 d，斑马鱼体内SOD酶活性。结果表明，4-CP、2，4-DCP和2，4，6-TCP的7 d KBCF分别为33.65±5.29、65.54±10.49和128.05±39.83，富集能力表现为4-CP（无富集）＜2，4-DCP（轻度富集）＜2，4，6-TCP（轻度富集）；斑马鱼对氯代酚类物质的富集性与氯酚类物质氯原子取代个数正相关。3种氯酚胁迫斑马鱼结果表明，暴露1 d表现为诱导－抑制效应，暴露7 d表现为抑制效应，酶活性变化显著。

斑马鱼；对氯酚；2，4-二氯酚；2，4，6-三氯酚；超氧化物歧化酶

随着我国经济的快速发展，工业废水和城市生活污水排放日益增多，生态环境压力越来越大。由于氯酚类化合物（chlorophenols，CPs）广泛应用于木材防腐、农业化学品、生物杀伤剂、染料、杀真菌剂和一般杀虫剂［1］等工农业产品的加工制造中，已成为水环境污染的主要污染物之一。研究发现，含有CPs的废水占我国工业废水总量的16%左右。CPs无疑是芳香族化合物中用途最广、毒性较大、污染较严重的一类化合物［2-3］。欧盟和美国国家环境保护局（US EPA）已将五氯酚（PCP）、2，4-二氯酚（2，4-dichlorophenol，2，4-DCP）和2，4，6-三氯酚（2，4，6-trichlorophenol，2，4，6-TCP）列为优先监测有机污染物之一［4］。该类物质在环境中具有高毒性、持久性以及难降解等特性，因此备受环保工作者的关注。

CPs可导致鱼类、软体动物以及哺乳动物的内分泌紊乱、免疫力下降和机体功能失调［5-6］，进而通过生态系统食物链和生物富集作用［7-9］，危害人体健康。近年来基于三苯基锡、五氯酚和重金属等物质暴露条件下，对水生生物的过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）以及斑马鱼（Zebrafish）早期胚胎生理发育影响的研究［10-16］有大量报道，但是对氯酚类物质胁迫斑马鱼的超氧化物歧化酶（SOD）却少有研究。因此笔者选用对氯酚（4-chlorophenol，4-CP）、2，4-DCP和2，4，6-TCP对斑马鱼进行毒性暴露试验，研究斑马鱼的7 d毒性富集作用和3种氯酚对斑马鱼SOD酶活性的影响，以7 d富集系数（KBCF）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活性为评价指标，将生物学科的生理生化指标引入环境毒理学研究中，评价污染物对环境的影响，以期为水生生态毒理学研究和政府部门制定各种水质标准和污染物排放标准提供理论数据支持。

1 试验

1.1 受试材料

以斑马鱼为试验材料。作为国际标准化组织（ISO）推荐的试验鱼种［17］，斑马鱼体型较小、来源方便、不受季节限制，其基因与人类基因相似程度达87%。试验用鱼购自北京某市场，鱼体长2.4～3.3 cm，体质量100～348 mg，雌雄各半，实验室驯养12 d，驯养条件满足GB/T 13267—1991《化学品测试方法》中203鱼类急性毒性试验［18］要求（间隔12 h光照，温度21～25℃，溶解氧浓度大于80%）。以重铬酸钾为参比物，在24 h试验期间K2CrO7的LC50（半数致死浓度）为200～400 mg/L，敏感性试验得出K2CrO7对斑马鱼暴露24 h LC50为367.85 mg/L，即Cr6＋对斑马鱼的24 h LC50为130.01 mg/L，结果满足标准规定的浓度范围，因此该批斑马鱼可用于毒性试验。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

先按照GB/T 13267—1991中鱼类急性毒性试验要求进行急性毒性试验，根据预试验结果，在包括鱼全部死亡的最低浓度和48 h鱼全部存活的最高浓度间，按照几何级数［19］，浓度梯度间隔系数≤2.2，划分5个浓度组（4-CP浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、11.0 mg/L；2，4-DCP浓度为1.0、2.5、4.0、5.5、7.0 mg/L；2，4，6-TCP浓度为1.0、1.3、1.5、1.7、1.9 mg/L），并设置空白和助溶剂对照（以丙酮为溶剂，以染毒物为溶质配置母液，再量取一定母液分别稀释到相应浓度，根据计算最大浓度组助溶剂使用量均为0.1 mL/L，满足助溶剂使用量标准要求体积比≤0.1 mL/L），连续试验96 h，重复试验3次。

1.2.2 7 d富集试验

毒性暴露试验：根据急性毒性试验结果，参照《化学农药环境安全评价试验准则》，以3种氯酚对斑马鱼的96 h LC50为基准，分别选择其1/3作为富集试验暴露浓度，用事先配置好的母液按富集试验暴露浓度分别配置4-CP（2.158 mg/L）、2，4-DCP（1.442 mg/L）、2，4，6-TCP（0.357 mg/L）染毒液。各取200 mL染毒液于250 mL烧杯，每个烧杯放入2条斑马鱼（斑马鱼平均质量89.5 mg，最大承载量为1.0 g/L），同时进行空白和助溶剂对照试验，每24 h更换1次染毒液，期间不喂食，观察鱼的生理情况。恒温培养箱持续暴露7 d后，斑马鱼低温冷冻杀死，吸干体表水称重，于冰箱冷冻层保存。

毒性测定：1）样品预处理，从冰箱冷冻层取出鱼，放入匀浆器，加入2 mL的10 mmol/L HCl匀浆后，移入离心管中，用蒸馏水润洗匀浆器3次，润洗液同样移入离心管，每管定容至9.00 mL，高速冷冻离心机（TGL－16M，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）以6 000 r/min离心10 min。2）离心后将上层液移入250 mL分液漏斗中，用少量蒸馏水润洗离心管，再加入50 mL蒸馏水稀释，加入10 mL环己烷，轻微振荡后倾斜漏斗，下端朝上轻开阀门放气，重复3次；剧烈振荡20次，静置2 h。3）静置分层后，弃除下层水相，有机相有乳化现象，加入2 mL无水乙醇，振荡溶解去乳化，继续静置分层，弃除下层水相，用长吸管取上层有机相移入10 mL离心管；用氮气吹至尽干，甲醇定容至2.00 mL，用注射器将样品过0.45 μm滤膜，移入小试管待测。4）移取50 mL染毒试验液，加入1mL mol/L HCl酸化，移入250 mL分液漏斗中，加入10 mL环己烷，按步骤3进行萃取。5）用高效液相色谱仪（Lab－600，北京莱伯泰科仪器有限公司）测定有机物浓度。

1.2.3 SOD酶活性测定试验

在25℃条件下，将每mg组织蛋白每min抑制邻苯三酚自氧化率达50%定义为1个酶活性单位，U/mg（以蛋白计，全文同）。SOD酶活性公式为：

式中，A为未添加酶源上清液的邻苯三酚自氧化速率；B为添加酶源上清液的邻苯三酚自氧化速率；V总为反应总体积，mL；V样为加入提取上清液的体积，mL；V定义为酶活性力单位定义体积，1 mL；C为提取液的蛋白质浓度，mg/mL。

毒性暴露试验：根据急性毒性试验结果，以斑马鱼的96 h LC50为基准，分别选择其1/5、1/10、1/12、1/15和1/20（表1）作为富集试验暴露浓度进行毒性暴露试验。用200 mL容量瓶配制染毒液并转移至暴露试验容器（250 mL烧杯），每个浓度组放入2条鱼，同时设置空白和助溶剂对照，每24 h更换1次染毒液，期间不喂食，观察鱼的生理情况。恒温培养箱培养，分别测定暴露1 d和7 d后，斑马鱼体内SOD酶活性。暴露试验结束后，斑马鱼低温冷冻杀死，吸干体表水称重，于冰箱冷冻层保存。

表1 斑马鱼SOD酶活性测定试验的染毒液浓度Table 1 The concentration of SOD activity determination in zebrafish

酶源上清液制备：将斑马鱼放入匀浆器中，按1∶10（质量/体积比）加入预冷的蔗糖－缓冲溶液（800 mg/L NaCl、400 mg/L EDTA、0.01 mol/L HCl－Tris、8.6×104mg/L蔗糖）冰浴匀浆，用高速冷冻离心机离心10 min（1℃，6 000 r/min）。取上清液用蔗糖－缓冲液稀释10倍，制成稀释100倍的提取液，即酶源上清液，于冰箱低温保存待用。

蛋白质浓度测定：根据考马斯亮蓝法（Bradford），取0.3 mL酶源液，加入0.15 mol/L的NaCl溶液1.7 mL，考马斯亮蓝（G－250）10.0 mL，反应5 min，在595 nm下测定吸光度，依据制定好的蛋白（牛血清白蛋白BSA）标准工作曲线，计算酶源液中蛋白质浓度。

SOD酶活性测定：采用邻苯三酚法。1）邻苯三酚自氧化速率测定。在25 mL比色管中加入10 mL Tris－HCl（pH为8.2）缓冲液，再加入9 mmol/L邻苯三酚0.2 mL，迅速倒入1 cm比色皿中混匀并计时，以Tris－HCl缓冲液为参比，于325 nm测定吸光度，从1 min开始，每30 s读数1次，连续读5 min，以吸光度对时间作图，斜率即为自氧化速率。2）测定SOD酶抑制邻苯三酚的自氧化速率。在25 mL比色管中加入10 mL Tris－HCl缓冲液、2 mL酶液，混匀后再加入9 mmol/L邻苯三酚0.2 mL，其余同邻苯三酚自氧化速率测定。

1.3 统计方法

数据用SPSS19.0软件进行计算处理，数据结果以均值±标准偏差表示，并以Origin8作图。

2 结果与分析

2.1 斑马鱼对 4-CP、2，4-DCP和 2，4，6-TCP的KBCF

富集系数是指生物体内某种元素或难分解的化合物的浓度与其所生存的环境中该物质的浓度之比，一般用来表示生物浓缩的程度。氯酚对斑马鱼的KBCF表示为：

式中，C鱼为氯酚在斑马鱼中的浓度，mg/g；C水为氯酚在水中的浓度，mg/g。

2.1.1 试验数据结果

按照1.2.2节的试验方法，进行7 d染毒液对斑马鱼的毒性暴露试验，得到各浓度组斑马鱼体内毒物的KBCF（表2）。

表2 斑马鱼对4-CP、2，4-DCP和2，4，6-TCP的KBCFTable 2 The KBCFof 4-CP，2，4-DCP and 2，4，6-TCP to zebrafish

2.1.2 结果分析

由表2可知，经过7 d暴露试验后，斑马鱼对4-CP、2，4-DCP和2，4，6-TCP的KBCF分别为33.645 ±5.292、65.541±10.492和128.051±39.828。

根据鱼体内毒物富集分类［20］，10＜KBCF≤60为无富集；60＜KBCF≤700为轻度富集；700＜KBCF≤8 000为中毒富集；KBCF大于8 000为高度富集。可以看出，在7 d暴露试验下，斑马鱼对4-CP无富集作用；对2，4-DCP和2，4，6-TCP表现出轻度富集。进一步分析可以得出，斑马鱼对3种氯酚物质的富集作用关系表现为4-CP＜2，4-DCP＜2，4，6-TCP，富集作用的大小与3种物质苯环上的氯原子取代基个数呈正相关，具体表现为随着酚类苯环上氯原子取代基个数的增多，富集作用增强。

梁丹涛等［21］以斑马鱼为受试物，进行了六六六对斑马鱼的生物富集作用研究，结果显示，暴露4 d时，KBCF为2.58×104，当暴露延长到6 d时，KBCF增加到3.10×104。与该研究结果相比，斑马鱼对所选择的易挥发的3种氯酚富集作用小得多。分析原因不难得出，六六六作为PCPs之一，其难降解、高持久等特性使得其在动物体内的富集速度非常快。邹积鑫等［22］进行了乙羧氟草醚对斑马鱼的急性毒性和生物富集性研究，富集试验设置2个浓度（0.03和0.30 mg/L），暴露时间持续8 d，测得KBCF分别为1.16和2.43，由于乙羧氟草醚水溶性差，降解快，因此表现为无富集；综合考虑可以得出，同种受试物（斑马鱼）对不同物质的富集能力不同，其富集能力可相差达到数量级。

2.2 3种氯酚对斑马鱼SOD酶活性的影响

2.2.1 4-CP对斑马鱼酶活性影响

4-CP对斑马鱼酶活性影响如图1所示。由图1可知，斑马鱼在4-CP浓度为0.323 8～1.290 5 mg/L的各组暴露1 d，斑马鱼SOD酶活性性均显著高于空白，说明SOD酶活性均被诱导。整体表现为随着暴露浓度的增加，酶活性先降低再升高，在4-CP浓度为0.539 6 mg/L处酶活性表现为最大，约为空白的2倍；在4-CP浓度为0.431 7 mg/L处酶活性表现为最小，为空白的124%。随着暴露时间延长至7 d，在4-CP浓度为0.323 8 mg/L处对斑马鱼的SOD酶活性高于空白，表明此时该浓度下的SOD酶活性被诱导，SOD酶活性为（141.63±13.90）U/mg；在4-CP浓度为0.431 7～1.290 5 mg/L时对斑马鱼的SOD酶活性均低于空白，随浓度的增加，酶活性表现出先下降后升高再下降的趋势，SOD酶均被抑制。综合1 d和7 d的暴露结果可知，在4-CP浓度相同时，4-CP暴露7 d对斑马鱼SOD酶活性均低于暴露1 d对斑马鱼的SOD酶活性。说明随着暴露时间的延长，4-CP对斑马鱼表现出先诱导后抑制效应。

图1 4-CP浓度对斑马鱼SOD酶活性影响Fig.1 The effect of 4-CP on SOD activity of zebrafish

2.2.2 2，4-DCP对斑马鱼酶活性影响

2，4-DCP对斑马鱼酶活性影响如图2所示。由图2可以看出，斑马鱼在2，4-DCP浓度为0.216 3～0.865 4 mg/L的各组暴露1 d，2，4-DCP对斑马鱼SOD酶活性均大于空白，表现为诱导效应。1 d暴露试验表现为随着暴露浓度的增加，斑马鱼SOD酶活性先升高再降低，再升高再降低，2，4-DCP浓度为0.288 5 mg/L时斑马鱼酶活性表现为最大（575.7± 17.6）U/mg，约为空白的4.5倍；在2，4-DCP浓度为0.865 4 mg/L时，酶活性表现为最小（178.6±7.9）U/mg，为空白的138%。当暴露时间延长至7 d时，可看出各浓度组斑马鱼的SOD酶活性均略小于空白，在7 d暴露试验整体表现为随着浓度的增加，斑马鱼的SOD酶活性先下降再升高，斑马鱼的SOD酶活性均被抑制。综合1 d和7 d的暴露结果得出，2，4-DCP暴露7 d对斑马鱼的SOD酶活性均低于暴露1 d对斑马鱼的SOD酶活性，说明随暴露时间的延长，2，4-DCP对斑马鱼表现出先诱导后抑制效应。

图2 2，4-DCP浓度对斑马鱼SOD酶活性影响Fig.2 The effect of 2，4-DCP on SOD activity of zebrafish

2.2.3 2，4，6-TCP对斑马鱼酶活性影响

2，4，6-TCP对斑马鱼酶活性影响如图3所示。由图3可知，斑马鱼在2，4，6-TCP浓度为0.056 6～0.226 4 mg/L的各组暴露1 d，对斑马鱼的酶活性均大于空白，均表现为诱导效应，1 d暴露分析可得，随着暴露浓度的增大，斑马鱼的SOD酶活性先升高后下降，并在 0.094 3 mg/L浓度处表现为最大（815.9±27.8）U/mg，约为空白的6倍；在0.226 4 mg/L浓度处表现为最小，约为空白的3倍。随着暴露时间延长至7 d，在2，4，6-TCP浓度为0.056 6 mg/L时斑马鱼SOD酶活性略大于空白，其余浓度组斑马鱼SOD酶活性均小于空白，7 d暴露表现为随浓度的增大酶活性逐渐减小，整体表现为抑制效应。综合1 d和7 d的暴露结果可知，相同浓度下，暴露7 d的2，4，6-TCP对斑马鱼的SOD酶活性均低于暴露1 d斑马鱼的SOD酶活性，说明随暴露时间的延长，2，4，6-TCP对斑马鱼表现出先诱导后抑制效应。

图3 2，4，6-TCP浓度对斑马鱼SOD酶活性影响Fig.3 The effect of 2，4，6-TCP on SOD activity of zebrafish

SOD是机体内天然存在的最重要的超氧自由基清除因子，可把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。综上分析，3种氯酚对斑马鱼SOD酶活性的影响，暴露1 d时，在低浓度的3种氯酚刺激下，使斑马鱼产生更多的SOD来抑制外界刺激，导致SOD酶活性升高，即表现为诱导作用，随着浓度的增大和时间的延长，外界刺激也增大，导致斑马鱼产生SOD生理功能受到损害，间接导致SOD酶活性降低，即表现为抑制作用。

3 结论

（1）斑马鱼对2，4-DCP、2，4，6-TCP表现出轻度富集性，对4-CP无富集。斑马鱼对3种氯酚的富集顺序为4-CP（无富集）＜2，4-DCP（轻度富集）＜2，4，6-TCP（轻度富集）。随着酚类苯环上氯原子取代基个数的增多，富集作用增强。

（2）综合3种氯酚对斑马鱼SOD酶活性试验得出，经过1 d暴露，对SOD酶活性呈先诱导后抑制效应，暴露延长至7 d时SOD酶活性被抑制。

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Study on Bioconcentration of Three Chlorophenols in Zebrafish and SOD Activity Stress Action

SONG Zhi-hui1，2，SUN Xin-xin2，LI Han-dong1
1.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment，Chinese Research Academy of Environmental Sciences，Beijing 10012，China
2.College of Environment and Safety Engineering，Qingdao University of Science＆Technology，Qingdao 266042，China

To study the physio-toxicity effect of 4-chlorophenol，2，4-dichlorophenol and 2，4，6-trichlorphenol on zebrafish，the evaluation indicator of 7 d KBCFand SOD activity with different exposure concentrations were determined using zebrafish by semi-static test.The results showed that the 7 d KBCFof 4-CP，2，4-DCP and 2，4，6-TCP to zebrafish were 33.65±5.29，65.54±10.49 and 128.05±39.83，respectively，and the bioconcentration factor followed the order of 4-CP＜2，4-DCP＜2，4，6-TCP.The bioconcentration of the chlorophenols to zebrafish and the numbers of chloro derivatives had positive correlation.The results of stress action test of the chlorophenols to zebrafish showed that the effect at 1 d was induction-inhibition and at 7 d the effect was inhibition，indicating significant variation of SOD activity.

zebrafish；4-chlorophenol；2，4-dichlorophenol；2，4，6-trichlorphenol；SOD

X174

A

10.3969/j.issn.1674-991X.2014.04.047

1674－991X（2014）04－0287－06

2014－01－28

环境保护公益性行业科研专项（201109037）

宋志慧（1972—），男，副教授，博士，主要从事环境生态毒理学、环境生物控制以及清洁生产审核咨询工作，songhuey＠sina.com

*责任作者：李捍东（1959—），女，研究员，博士，长期从事化学品环境效应及环境微生物研究，li_han_dong＠163.com