冬虫夏草口服液微生物限度检查方法学验证

冯 旭，汪家春，赵 龙，陈 虹，刁 琢，储智勇

·论著·

冬虫夏草口服液微生物限度检查方法学验证

冯 旭，汪家春，赵 龙，陈 虹，刁 琢，储智勇

目的 建立冬虫夏草口服液微生物限度检查方法，并对方法进行验证。方法 采用常规法，通过大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、黑曲霉5种阳性菌回收率试验进行细菌、霉菌和酵母菌计数方法的验证，同时对控制菌检查方法进行验证。结果 采用常规法计数细菌、霉菌及酵母菌时，各试验菌回收率在70%以上;控制菌检查中，各阳性试验菌均检出，阴性对照无菌生长。结论 可以采用常规法进行冬虫夏草口服液的微生物限度检查。

冬虫夏草口服液;微生物限度检查;方法验证

冬虫夏草口服液是由中国人民解放军海军医学研究所研制，以野生冬虫夏草及人工培养冬虫夏草菌丝体为原料生产的口服液制剂，具有滋阴补阳、益气补血的功效，可用于肿瘤患者放疗、化疗的辅助治疗。根据《中国药典》2010年版(一部)微生物限度检查法规定，在建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定和控制菌检查［1］。为更好地保证冬虫夏草口服液的安全性和疗效，本实验对冬虫夏草口服液进行了微生物限度检查的方法验证。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品和培养基

冬虫夏草口服液(规格:10 ml/瓶，海军医学研究所，批号:20130402、20130301、20130109);营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖增菌培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基(MUG)、蛋白胨均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 菌株

大肠埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B) 44102］，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］，白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(B)98001］，黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(B)98003］均购自上海食品药品检验所。

1.1.3 仪器

恒温培养箱，生化培养箱，电子天平，高压蒸汽灭菌器，净化工作台，三用紫外分析仪。

1.2 方法

1.2.1 供试液和菌液的制备

按文献［2］制成1∶10的供试液备用。按文献［2］制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的菌悬液，50～100 cfu/ml。

1.2.2 细菌、霉菌及酵母菌回收率检测

1.2.2.1 验证方法 采用平皿法，每个菌种的计数方法验证分为供试品试验组、菌液组、供试品对照组和稀释剂对照组。(1)供试品试验组:取1∶10供试液1 m l，及各50～100 cfu的试验菌1 ml，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌倾注营养琼脂培养基;白色念珠菌、黑曲霉倾注玫瑰红钠琼脂培养基。(2)菌液组:取上述制备菌液各1 m l注入平皿中，倾注相应的琼脂培养基。(3)供试品对照组:取上述1∶10供试液1 m l注入平皿中，倾注相应的琼脂培养基。(4)稀释剂对照组:取pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1 m l及各50～100 cfu的试验菌1 m l，分别注入平皿中，倾注相应的琼脂培养基。将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在34℃下培养48 h，将白色念珠菌、黑曲霉在27℃下培养72 h，点计菌落数。计算回收率，试验组菌数回收率=(试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数)÷菌液组的平均菌落数×100%，稀释剂对照组菌数回收率=(稀释剂对照组的平均菌落数÷菌液组的平均菌落数)×100%。

1.2.2.2 样品细菌、霉菌及酵母菌计数检查 取批号为20130402、20130301、20130109的样品各10 ml，分别加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，作为1∶10的供试液。取1∶10供试液10ml，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，作为1∶100的供试液。吸取各稀释级供试液各1 ml至无菌平皿中，每一稀释级每种培养基至少注2～3个平皿，细菌计数使用营养琼脂培养基，霉菌、酵母菌计数使用玫瑰红钠琼脂培养基。另取4 ml试验用稀释剂(pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液)分别注入4个平皿中(即1 ml/皿)，其中2个作细菌数阴性对照，另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照。混匀，细菌计数平板倒置于34℃培养箱中培养3 d，霉菌、酵母菌计数平板倒置于27℃培养箱中培养5 d。

1.2.3 控制菌检查方法的验证

1.2.3.1 菌种选择 冬虫夏草口服液为中药口服液体制剂，不含生药原粉，按《中国药典》2010年版附录微生物限度检查法中的有关控制菌检查方法，应检查大肠埃希菌，阴性对照菌为金黄色葡萄球菌。

1.2.3.2 菌液和供试液的制备 菌液按“1.2.1”方法制备，菌数控制在10～100 cfu/ml。供试液按“1.2.1”方法制备。

1.2.3.3 验证方法 取1∶10供试液10 ml加入到100 ml胆盐乳糖培养基中，再加入10～100 cfu大肠埃希菌悬液作为试验组;取1∶10供试液10 ml加入到100 ml胆盐乳糖培养基中，再加入10～100 cfu金黄色葡萄球菌悬液作为阴性菌对照组;取1∶10供试液10 ml加入到100 ml胆盐乳糖培养基中作为供试品对照组，在34℃培养18～24 h。取上述各培养物0.2 m l，接种至含5 m l MUG培养基的试管内培养，于5、24 h在366 nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照，若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性，若不呈现荧光，为MUG阴性。

2 结果

2.1 细菌、霉菌及酵母菌回收率结果

采用常规法检查冬虫夏草口服液对5株菌的抑菌活性，结果试验组菌数回收率均＞70%，说明本品无明显抑菌活性，可用常规法进行微生物限度检查。见表1。

2.2 样品细菌、霉菌及酵母菌计数检查结果

结果表明，20130402、20130301、20130109 3批样品按验证方法检查，细菌、霉菌或酵母菌总数均小于10 cfu/ml，符合规定。

2.3 控制菌检查法验证结果

观察后，沿管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色为靛基质阳性，呈试剂本色为靛基质阴性。结果显示，控制菌检查阳性菌生长良好，阴性菌均未检出，说明冬虫夏草口服液对大肠埃希菌没有抑制作用，可用常规法进行检验。见表2。

表1 常规法各查得试验菌株的回收率(%)

表2 各组控制菌检查法验证结果

3 讨论

中国药典2010年版微生物限度检查法中规定:微生物限度检查回收率试验中，若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌的菌数。本实验采用常规法对冬虫夏草口服液进行细菌、霉菌及酵母菌数测定，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率试验均高于70%，说明可直接采用常规法对冬虫夏草口服液进行细菌、霉菌及酵母菌数的计数。

在控制菌检查试验中，试验组检出大肠埃希菌，阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌，说明常规法可用于冬虫夏草口服液的控制菌大肠埃希菌检查。因此，可以直接采用常规法对冬虫夏草口服液进行微生物限度检查。

［1］ 国家药典委员会.中国药典:第一部［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:79-88，138.

［2］ 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:351-407.

［3］ 何进，顾明业，高军，等.桃红四物口服液微生物限度检查的方法验证［J］.解放军药学学报，2010，26(4):371-373.

［4］ 许华玉，杜芸，钱文静.药品微生物限度检查法中细菌和真菌计数方法的验证试验［J］.中国中药杂志，2005，30(24): 1918-1920.

Verification ofm icrobial lim it test for the Cordyceps sinensis oral liquid

FENG Xu，WANG Jia-chun，ZHAO Long，CHEN Hong，DIAO Zhuo，CHU Zhi-yong

(Naval Medical Research Institute，Shanghai200433，China)

Objective To establish amethod ofmicrobial limit test for Cordyceps sinensis oral liquid and to verify the validity of the testingmethod.Methods Conventionalmethodswere used to verify the countingmethods formicrobial，fungus and yeast counts through themeasurement of the recovery rates of5 positive bacteria in the Cordycepssinensis oral liquid.At the same time，the detection method for the control bacteria in the Cordyceps sinensis oral liquid was also verified.Results When conventional detection methods were used，the recovery rates of various bacteriawere over70%.In the detection of the control bacteria，positive testbacteriawere all detected，while no bacterial growth was detected in the control.Conclusion Conventionalmethods could be used for the detection of microbial limit in the Cordyceps sinensis oral liquid.

Cordyceps sinensis oral liquid;Microbial limit test;Verification of themethod

R284.1

A

10.3969/j.issn.1009－0754.2014.06.003

2014－02－06)

(本文编辑:张阵阵)

全军医药卫生科技基金(14TG0295)

200433 上海，海军医学研究所(冯旭、汪家春、储智勇);天津科技大学(赵龙、陈虹、刁琢)

储智勇，电子信箱:zhiyongchuleader@163.com