肾敷灵外敷配合雷公藤多甙对难治性肾病大鼠肾组织炎症因子NF-κB及TGF-β的影响

张雪荣 李云海

（湖北中医药大学金匮教研室，武汉430061）

肾敷灵外敷配合雷公藤多甙对难治性肾病大鼠肾组织炎症因子NF-κB及TGF-β的影响

张雪荣 李云海

（湖北中医药大学金匮教研室，武汉430061）

目的观察肾敷灵外敷配合雷公藤多甙对难治性肾病大鼠的炎症因子NF-κB及TGF-β的影响。方法按照随机化的原则分为4组：正常组、模型组、对照组、治疗组，实验第7天开始灌胃，正常组、模型组每天灌胃生理盐水；对照组每天灌胃雷公藤多甙混悬液；治疗组在对照组治疗基础上外敷肾敷灵于大鼠神阙、肾腧、脾腧穴位。实验前和实验开始后2周、4周收集大鼠24小时尿液检测24小时尿蛋白定量；实验结束后Western Blot方法检测肾组织中NF-κB、TGF-β的水平。结果实验第14天、28天，模型组、对照组及治疗组大鼠24h尿蛋白显著高于正常组；与模型组相比，对照组及治疗组24h尿蛋白量均显著受到抑制（P＜0.01）；治疗组24h尿蛋白量28天低于对照组（P＜0.01）；实验第28天，与正常组相比，模型组、对照组、治疗组大鼠肾组织中NF-κB、TGF-β的表达明显上调（P＜0.01）；与模型组相比，对照组及治疗组明显降低（P＜0.01）；其中NF-κB的水平治疗组则明显低于对照组（P＜0.01）。结论肾敷灵外敷配合雷公藤多甙可通过抑制NF-κB、TGF-β表达，减轻难治性肾病大鼠肾小球的炎症反应，从而抑制肾小球的损伤。

难治性肾病；肾敷灵；NF-κB；TGF-β；中药外治

“难治性”肾病国外［1］统称复发性肾病（RNS），是指除外继发性肾病，而属原发性肾病者，约占小儿原发性肾病10%。我国临床上常对下述情况称之“难治性肾病”：激素耐药即指经泼尼松足量正规治疗8周无效应，尿蛋白仍≥+++，或部分效应，尿蛋白仍+～++；频繁复发即指半年内复发2次或1年内复发3次者；激素依赖即指用药后缓解，减量或停药后4周内复发，恢复用药仍有效，并重复3次以上者。本病多见于3～7岁儿童，多数患儿预后良好，少数患儿因其反复发作，病程长或激素及细胞毒类药物的副作用等，严重影响儿童身心健康。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验用动物：4～5周龄雄性SPF级健康雌性SD大鼠40只，体重130～150g，由华中科技大学同济医学院动物中心提供。喂养一周后，开始实验。

1.2 实验药品

1.2.1 肾敷灵肾敷灵的制备在湖北省中医院制剂室完成，方法：将黄芪、仙茅、肉苁蓉、吴茱萸、川芎混合研磨成80目粉末，加生姜汁及1%～2%促皮渗透剂水溶性桂氮酮，少许甘油，调成膏状，密封在冰箱里。

1.2.2 雷公藤多甙片贵州汉方制药有限公司，10mg／片，国药准字：Z52020369，批号：110401。

1.2.3 注射用盐酸多柔比星（阿霉素）浙江海正药业股份有限公司，10mg／瓶，国药准字：H20041318，批号：101101。

1.3 实验试剂一抗：actin兔来源抗体，Santa公司，货号：Sc-1616r，分子量：43KD；NF-κB兔来源抗体，Santa公司，货号：sc-114，分子量：50KD；TGF-β兔来源抗体，Santa公司，货号：sc-146，分子量：25KD。二抗：HRP标记的山羊抗兔。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠阿霉素肾病模型的建立给造模组大鼠尾静脉一次性注射阿霉素6.0mg／kg（阿霉素按2mg／ml溶于生理盐水中，即3.0ml／kg）；正常组大鼠尾静脉一次注射生理盐水3.0ml／kg。

1.4.2 动物分组按照随机化的原则进行分组：正常组、模型组、对照组（雷公藤多甙灌胃）、治疗组（肾敷灵外敷加口服雷公藤多甙灌胃），各组大鼠均为10只。

1.4.3 实验药品配置将阿霉素注射液、雷公藤多甙均用生理盐水配成2mg／ml的浓度。

1.4.4 给药剂量实验第7天开始灌胃，给药均现用现配，具体剂量如下：

正常组及模型组：每天生理盐水灌胃，剂量为1ml／100g／d；对照组：每天雷公藤多甙混悬液灌胃，剂量为1ml／100g／d；治疗组：在对照组治疗基础上在大鼠神阙、肾腧、脾腧穴位上外敷肾敷灵。把肾敷灵做成约黄豆大小的药丸贴于每个穴位，用巴布剂固定（治疗前用电推剪剪除穴位处的鼠毛），每日1次，每次敷贴8～10小时。

1.4.5 标本采集及处理实验前和实验开始后2周、4周收集大鼠24小时尿液，用代谢笼收集24h尿液，用量杯摇匀取3ml，3000r／min离心5分钟，去除沉渣，应用全自动生化检测仪动态检测尿蛋白定量。

实验第28天结束时，取肾脏组织，处理后光镜下观察各组大鼠肾组织的病理改变；并用Western Blot法检测NF-κB及TGF-β的表达。

1.4.6 统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行分析。全实验数据结果均以均数±标准差表示，计量资料比较采用单因素的方差分析，P＜0.05或P＜0.01为有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间点24h尿蛋白水平见表1。

表1 各组大鼠不同时间点24小时尿蛋白定量分析结果

表1 各组大鼠不同时间点24小时尿蛋白定量分析结果

注：与正常组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0. 01；治疗组与对照组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01

组别n 0天（mg／24h）14天（mg／24h）28天（mg／24h）正常组10 4.15±2.02 6.17±3.19 6.35±2.67模型组10 4.06±1.64 126.28±18.07▲▲278.87±25.68▲▲对照组10 4.18±1.78 66.53±12.48▲▲△△85.63±21.55▲▲△△治疗组10 4.21±1.89 60.25±13.64▲▲△△56.37±24.64▲▲△△★★

根据上表，实验第14天、28天，模型组、对照组及治疗组大鼠24h尿蛋白显著高于正常组；与模型组相比，对照组及治疗组24h尿蛋白量均显著受到抑制（P＜0.01）；治疗组24h尿蛋白量28天低于对照组（P＜0.01）。

2.2 光镜下各组大鼠肾小球病理改变详见图1。

图1 光镜下各组大鼠肾小球病理改变

2.3 实验第28天各组NF-κB、TGF-β的Western Blot的蛋白变化见表2。

表2 实验第28天各组NF-κB、TGF-β蛋白变化

表2 实验第28天各组NF-κB、TGF-β蛋白变化

注：与正常组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较△P＜0. 05，△△P＜0.01；治疗组与对照组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01

组别n NF-κB TGF-β正常组10 0.18±0.02 0.19±0.03模型组10 0.79±0.06▲▲0.75±0.07▲▲对照组10 0.56±0.03▲▲△△0.40±0.03▲▲△△治疗组10 0.31±0.04▲▲△△★★0.38±0.02▲▲△△

根据上表，实验第28天，与正常组相比，模型组、对照组、治疗组大鼠肾组织中NF-κB、TGF-β的表达明显上调（P＜0.01）；与模型组相比，对照组及治疗组明显降低（P＜0.01）；其中NF-κB的水平治疗组则明显低于对照组（P＜0.01）。

3 讨论

小儿难治性肾病病理类型多样，以MeSPGN、FSGS、MCD多见［3-4］。通过国内外文献资料检索，没有发现其动物模型建立成功的统一标准。本实验以经典的肾病阿霉素肾病大鼠作为难治性肾病综合征动物模型。实验第14天、28天，模型组、对照组及治疗组大鼠24h尿蛋白显著高于正常组，光镜结果显示：发现正常组大鼠肾小球系膜区无增生、沉积物，基底膜未见病变，毛细血管开放正常；模型组大鼠可见弥漫性肾小球系膜区增宽，系膜细胞、系膜基质增生，毛细血管腔狭窄；雷公藤多甙组和肾敷灵合并雷公藤多甙组病变均不同程度减轻。通过对难治性肾病大鼠的蛋白尿及病理学研究，说明本次研究模型制作成功。

肾敷灵主要由黄芪、肉苁蓉、川芎、仙茅、吴茱萸组成，借膏药渗透和吸收，通过血脉、经络使药力直达病所，以补先后天之本，健脾温阳化湿、调和气血，疏通经络，使诸虚得补，正气得固，邪气得除，使疾病向愈。而已知雷公藤多甙对难治性肾病具有皮质激素样的治疗作用，但不存在激素的不良反应，其疗效值得肯定。

普遍认为难治性肾病的发病与免疫功能紊乱相关，多种炎症介质参与肾病的病理生理过程且与临床表现密切关联。炎症因子通过与细胞的相互作用，共同影响着肾脏疾病的发生和转归。核因子-KappaB（NF-κB）在各种因子相互影响和相互作用的复杂网络中，起着中心调控作用。由于NF-κB转录调节多种细胞因子和炎症介质，被认为是炎症级联反应的中心靶点，其活性直接影响IL-6、TNF-a等细胞因子的表达水平，而且其表达水平的变化先于其他炎性细胞的激活和炎症因子的释放。从而可见，NF-κB是早期炎症的标志性因子。赵润民［5］等发现注射阿霉素后第7天，大鼠肾皮质组织NF-κB活性开始升高，28d达高峰，明显高于正常对照组（P＜0.01），阿霉素肾病大鼠肾皮质中NF-κB DNA结合活性异常升高，CsA可通过抑制NF-κB活性减少尿蛋白排泄量。转化生长因子β（TGF-β）正常表达时，能够抑制炎症反应，通过抑制细胞增殖而维持正常的细胞数量；过度表达时，参与炎症反应，促进细胞外基质（ECM）的合成和分泌，抑制ECM的降解，还能诱导肾间质肌成纤维细胞的聚集，是促进肾纤维化的最重要的细胞因子之一。史伟［6］实验结果表明，在肾小球硬化肾炎各组中肾小球内TGF-β1、Smad2、Smad3、FN的蛋白表达均明显高于正常对照组，认为TGF-β1及其信号转导分子Smads蛋白可能参与了ECM在病变肾小球中的过量蓄积，从而在肾小球硬化过程中起重要作用。

本次研究结果提示肾敷灵外敷合并雷公藤多甙可以下调难治性肾病大鼠肾组织中的NF-κB及TGF-β的表达水平，从而减轻这两种炎症因子的表达，并且治疗组降低NF-κB水平方面优于TGF-β，提示其在肾脏病理改变早期即可阻断炎症因子，以减轻肾脏免疫性炎症的改变，减少肾脏中系膜细胞、内皮细胞及上皮细胞的损伤，保护大鼠肾小球和肾小管的功能，防止肾脏病理改变加重，以阻断终末期病理改变的进展。通过此次研究，可初步明确肾敷灵外敷合并雷公藤多甙在早期可下调炎症因子的水平，阻断朝肾纤维化的发展，这可能是其治疗小儿难治性肾病的机制之一，值得临床推广应用。

［1］杨霁云，白克敏.小儿肾脏病基础与临床［M］.北京：人民卫生出版社，2000：164.

［2］黄文彦，黄松明，甘卫华，等.小儿难治性肾病病理特征的研究［J］.中国实用儿科杂志，1999，14（11）：681-682.

［3］毕丹青，毕丹艳，王彩琼，等.难治性肾病综合征48例病理临床观察［J］.中国中西医结合肾病杂志，2003，4（8）：462-463.

［4］沈辉君，刘爱民，戴宇文，等.难治性肾病综合征患儿51例临床与病理关系及预后分析［J］.实用儿科临床杂志，2007，22（17）：1319-1320，1334.

［5］赵润民，卢思广，陈瑜，等.阿霉素肾病大鼠肾皮质糖皮质激素受体与核因子-κB活性的变化［J］.中国医师杂志，2006，8（5）：588-591.

［6］史伟，何朝生，刘双信，等.转化生长因子131及Smad信号转导通路在肾小球硬化中的作用［J］.中华肾脏病杂志，2005，21（5）：270-273.

Ef f e c t s o f Renal Tis s ue In flamma t o r y Fa c t o r NF-κB an d TGF-βon t h e Tr ea tme n t o f Re f r a c t o r y Ne p h r o tic Rat b y Ex t e r nal Usin g She n f ulin g Combin e d wit h Trip te r y giu m Gl y c osid e s

Zhang Xuerong,LiYunhai
(Synopsis of the Golden Chamber,Hubei University of TCM,Wuhan,Hubei Province,430061,China)

ObjectiveTo observe the effects of renal tissue inflammatorx factor NF-κBand TGF-βon the treatment of refractorx nephrotic rat bx ewternal used Shenfuling combined vith tripterxgium glxcosides in this ewperiment.Methods4 groups vere randomlx divided into normal group，model group，control group，treatment group.The rats in the model group，control group，treatment group

adriamxcin 6.0mg／kg a single intravenous injection and gastric perfusion in the seventh dax of the ewperiment，normal group，model group vas gavaged vith normal saline dailx；the control group vere gavaged tripterxgium glxcosides suspension dailx；on the basis of the control group treatment the treatment group received ewternal used Shenfuling on the point for ewample Shenque，Shenshu，Pishu acupoint.Before the ewperiment，2 veeks and 4 veeks after the ewperiment 24 hours urine of rats vere collected to detect 24 urinarx protein；after the ewperiment NF-κB，TGF-βlevel in the renal tissue vere detected bx Western Blot method.Results14 dax，28 dax，24h urine protein of rats in the model group，control group and treatment group vas significantlx higher than that in normal group；compared vith the model group，24h urinarx protein in the treatment group and control group vere significantlx inhibited（P＜0.01）；24h urinarx protein 28 daxs in treatment group vas less than that in control group（P＜0.01）；28 dax of the ewperiment，the ewpression of NF-κB，TGF-βin the rat renal tissue of the model group，control group and treatment group vas significantlx up-regulated compared vith the normal group（P＜0.01）；compared vith the model group，control group and treatment group decreased significantlx（P＜0.01）；the NF-κB levels in treatment group vas significantlx lover than that of the control group（P＜0.01）.ConclusionEwternal used Shenfuling combined vith tripterxgium glxcosides can inhibit the ewpression of NF-κB and TGF-β，reduce the inflammation of refractorx glomerular nephropathx rats，inhibit glomerular injurx.

Refractorx nephrotic sxndrome；Shenfuling；NF-κB；TGF-β；Ewternal treatment of traditional Chinese Medicine

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.02.103

：1672-2779（2014）-02-0152-03

��张文娟 本文校对：李云海

2013-10-12）