青蒿素衍生物抗癌机制探讨

曹智刚?袁守军?陈惠鹏?徐兰平?田增月

【摘要】 目的 探讨青蒿素衍生物诱导肿瘤细胞产生自由基， 引导肿瘤细胞死亡的机制。方法 测定小鼠肿瘤动物模型的瘤体铁含量、观察青蒿素衍生物诱导肿瘤细胞产生自由基、采用单细胞彗星电泳法观察自由基对肿瘤细胞DNA杀伤的效应。结果 小鼠的H22瘤体的铁含量显著高于血和肌肉、肺组织铁含量， Lewis肺癌的实验结果相同。K562细胞经青蒿素衍生物作用， 能测出微量的自由基。青蒿素衍生物作用K562细胞可引起DNA损伤并溢出细胞。结论 青蒿素衍生物可在含铁量较高的肿瘤细胞内产生自由基， 导致肿瘤细胞死亡。

【关键词】 青蒿素衍生物；肿瘤；铁

Approach free radical of artemisinine derivatives for anticancer mechanism CAO Zhi-gang， YUAN Shou-jun， CHEN Hui-peng， et al. Dalian Sanatorium Taoyuan Branch， Dalian 116013， China

【Abstract】 Objective To explore mechanism of artemisinine derivatives induced tumor of cytogenic free radical and loading to tumors cell death. Methods Iron-content for tumor body of mouse tumor of animal model was evaluated and the antipersonnel effect of tumor of cytogenic free radical for DNA with artemisinine derivatives by Mono-cell comet caraphoresis induced was studied. Results The iron-content of blood， muscle and lung is toper of tumor-body. artemisinine derivatives induced K562 tumor cell of cytogenic free radical and caused DNA damnification and flowed outward of cell envelope. Conclusion Artemisinine derivatives can induce tumor of cytogenic free radical to kill tumor.

【Key words】 Artemisinine derivatives； Toumer； Iron

自90年代以来发现青蒿素类药物有一定的抗癌作用。青蒿素类药物因化学结构与目前临床上常用的化疗药有所不同， 治疗疟疾的临床应用显示药物毒副作用小， 展现了抗癌的发展前景， 但青蒿素抗癌的机理尚不清楚。本文就青蒿素衍生物的自由基抗癌机制进行探讨， 研究青蒿素衍生物诱导肿瘤细胞产生自由基， 引导肿瘤细胞死亡的机理。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 实验材料 细胞株采用K562， 小鼠是昆明种及C57小鼠， 18～22 g，雌雄兼用， 铁测定采用血清铁试剂盒， RnaseA， 荧光染料罗丹明123。使用CHK型光学显微镜， 凝胶成像扫描仪等观察。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 小鼠肿瘤动物模型的瘤体铁含量测定方法 将昆明小鼠接种Lewis肺癌株和H22肝癌株， 接种时间为7 d， 后将实验鼠断颈处死， 取出肿瘤称重。制备肿瘤匀浆采用每克瘤重加1 ml生理盐水并混匀。取1 ml肿瘤匀浆离心， 吸取上清液。经1：4比例稀释后。以3000 r/min速度高速离心， 各瘤体组织取样250 μl上清液用吸光度波长540 nm测定铁匀浆浓度， 并比对标准血清铁。测定OD值， 数据作统计学处理。

1. 2. 2 青蒿素衍生物诱导肿瘤细胞产生自由基的测定 将K562细胞计数后收集在100 ml 培养瓶中， 每瓶收集约1000万个细胞。1640（+）培养液培养后， 将实验组K562细胞培养液中加入青蒿素衍生物药物达终浓度4 μg/ml。原液35 μg/ul，配成1 ug/μl， 每培养瓶加药20 μl处理30 min。放入5%CO2， 37℃温箱中孵育。对照组的处理条件相同。离心， 孵育后收集细胞上清液加自由基捕捉剂， 用ESP300电顺磁共振波谱仪检测自由基。

1. 2. 3 肿瘤细胞彗星电泳实验 A549细胞经CO2孵箱中培养生长近饱和时， 加入青蒿素衍生物（终浓度为50 μg/ml）， 作用24 h。用PBS冲洗， 吸取90 μl 1%琼脂糖（约70℃）均匀涂于载坡片上， 取50 μl细胞液和1% LMA用1：3比例在37℃条件下混匀并快速吸取90 μl， 均匀涂布在低层胶上， 浸入溶解液中， 再浸入解旋液中， 浸入电泳槽中， 用65 V电泳10～20 min玻片上染色10 min， 反射式荧光显微镜下观察溢出情况并照相。

2 结果

2. 1 小鼠肿瘤动物模型的瘤体铁含量测定 测定H22肝癌模型和Lewis肝癌模型的小鼠瘤体的铁含量， 瘤体来源分别为血、肌肉、肺组织。瘤体的铁含量高于血和肌肉、肺组织的铁含量。

2. 2 经青蒿素衍生物处理肿瘤细胞， 测定自由基 经青蒿素衍生物处理K562细胞， 可产生微量的自由基。

2. 3 单细胞彗星电泳评定DNA损伤的实验结果 青蒿素衍生物处理K562细胞导致DNA损伤并溢出细胞膜， 能观察到细胞拖尾现象， 青蒿素产生的自由基可引起 DNA的损伤。endprint

3 讨论

青蒿素类药物抗肿瘤机制类同抗疟药的作用机制。青蒿素的抗疟通过铁离子， 能促进青蒿素的过氧基团分解， 产生自由基， 攻击疟原虫。因肿瘤细胞的核酸代谢需要更多的铁， 实验观察癌细胞内的铁含量远高于正常细胞， 许多肿瘤细胞表面转铁蛋白受体明显高于正常细胞转铁蛋白受体；肿瘤中的铁可能引导青蒿素产生更多的过氧化基团， 提示青蒿素类药物可能选择性杀伤肿瘤细胞。

Singh等[1]观察并报道将转铁蛋白和双氢青蒿素同时使用可选择性杀伤molt-4淋巴白血病细胞和淋巴细胞， 对人乳癌细胞也具有较强的选择性毒性作用。使用硫酸亚铁并合用双氢青蒿素， 可减慢大鼠的移植纤维肉瘤生长[2]。

作者前期研究[3]观察到双氢青蒿素较强的抑制小鼠肿瘤模型中肿瘤的生长， 测定小鼠的肿瘤瘤体的铁含量明显高于血和肌肉、肺组织的铁含量， 显示了青蒿素类药物对肿瘤细胞可能存在特异性杀伤效应， 即青蒿素对机体杀伤作用小， 对体内肿瘤杀伤作用强， 由此青蒿素类药物治疗肿瘤， 药物的副作用可能较小。实验也证实肿瘤细胞铁代谢旺盛， 瘤体铁含量较高。

实验也表明， 通过青蒿素衍生物处理K562细胞， 可产生微量的自由基。青蒿素衍生物作用K562细胞后引起DNA损伤并溢出细胞膜形成拖尾现象， 提示增加肿瘤细胞内的铁含量， 有可能增加青蒿素衍生物处理肿瘤细胞后， 肿瘤细胞内自由基量的增加， 提高青蒿素衍生物的抗癌效应。

合用铁与青蒿素衍生物， 明显增强青蒿素衍生物杀伤肿瘤细胞的能力， 使用青蒿素衍生物治疗肿瘤， 可以为肿瘤的治疗提供一种新的治疗思路。也可以提示某种青蒿素衍生物与铁合成有可能成为复方抗癌药物。

参考文献

[1] Singh NP， Lai H. Selsective toxicity of dihydroartemiasnin and holotransferrin toward human breast cancer cells. Life Science， 2001，70（1）：49-56.

[2] Moore JC， Lai H， Li JR， et al. Oral administration of dihydroarte-miasnin and ferrous sulfate retarded implanted fibrosarcoma growth in the rat. Cancer Lett， 1995，98（1）：83.

[3] 曹智刚，袁守军.双氢青蒿素对肿瘤细胞及肿瘤动物模型的抑制作用.实用医学杂志， 2006（24）：2835-2837.endprint