专一营养与兼性甲烷氧化菌降解氯代烃的研究现状、动力学分析及展望

邢志林，张丽杰，赵天涛,2

1重庆理工大学化学化工学院，重庆 400050 2重庆大学城市建设与环境工程学院，重庆 400045

三氯乙烯 (Trichloroethylene, TCE)、四氯乙烯 (Tetrachloroethylene, PCE) 等氯代烯烃和氯仿 (Chloroform, CF)、三氯乙烷 (Trichloroethane,TCA) 等氯代烷烃的不当使用给人类环境造成了严重污染[1-2]。研究发现甲烷氧化菌能够降解多种氯代烃类污染物[3-6]，甲烷单加氧酶(Methane monooxygenase，MMO) 在降解过程起着关键作用[7]。甲烷氧化菌能够产生两种类型的MMO：溶解甲烷单加氧酶 (Solution methane monooxygenase，sMMO) 和颗粒甲烷单加氧酶(Particulate methane monooxygenase，pMMO)[8]，由于两种酶在底物范围、底物亲和性和对抑制剂敏感程度等方面的差异性，导致不同菌株催化降解氯代烃范围和效率的不同。研究者已经从各个方面对氯代烃的降解做了研究，包括甲烷氧化菌对不同氯代烃的降解效果[9-10]、氯代烃降解机理和其动力学[11-12]以及氯代烃生物降解的实际应用[13-14]等。

兼性甲烷氧化菌 (Facultative methanotrophs)与专一甲烷氧化菌相比有着独特的生理学和底物选择特性，因可以利用含碳碳键的有机物作为碳源和能源而更容易实现富集，已经展现出广阔的工程应用前景[15-16]。兼性甲烷氧化菌能利用乙酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸和乙醇等多碳化合物[17-20]，且有些多碳化合物可被兼性甲烷氧化菌优先利用，从而使得兼性甲烷氧化菌降解氯代烃日益成为了研究热点。

对国内外文献进行调研，介绍甲烷氧化菌降解氯代烃的综述性文献并不多见。韩冰等[21]从现代生物技术角度介绍了甲烷氧化菌的分类与分布、MMO的结构与功能，其中提及了氯代烃的生物降解但未做系统阐述；魏素珍[22]介绍了甲烷氧化菌种类及其在温室气体减排、污染物治理方面的应用现状和应用前景，涉及了共代谢的概念及氯代烃对甲烷氧化的影响；鲍伦军等[23]描述了多种降解卤代烃菌株的降解特性、降解途径等；Jiang等[24]、Brigmon[25]和Sermau[26]着重介绍了甲烷氧化菌在环境工程中的应用前景和未来的发展方向，同时也提及了兼性甲烷氧化菌降解氯代烃类污染物以及反应器设计的研究成果；Sullivan等[27]以甲基弯菌Methylosinus trichosporiumOB3b为模型菌株较详细介绍了MMO的结构、类别及其在降解污染方面的应用潜力。以上综述对了解氯代烃污染物生物降解的发展具有重要的指导价值，但有针对性地阐述甲烷氧化菌降解氯代烃还相对不足，尤其是氯代烃降解动力学和兼性甲烷氧化菌降解氯代烃的综述还未见报道。

据此，本文总结了国内外相关的研究成果，并结合本课题组在甲烷氧化菌降解氯代烃方面的研究进展，分析了纯菌株和混合菌株对不同氯代烃的降解效果，考察了不同类型甲烷单加氧酶在不同底物体系中的活性表达和催化特性，总结了模型菌株M. trichosporiumOB3b降解氯代烃的动力学特性，简述了兼性甲烷氧化菌降解氯代烃的特性及其应用潜力，并浅析了所存在的问题及未来的研究方向。

1 甲烷氧化菌和MMO降解氯代烃及降解动力学研究

1.1 可降解氯代烃的甲烷氧化菌及其生物特性

1985年Wilson等[28]首次发现了富含甲烷氧化菌的土壤在天然气刺激下能够降解TCE，这打破了甲烷氧化菌只能利用甲烷的传统认识，并在一定程度上促进了兼性甲烷氧化菌的发现。随后的十几年，研究者利用不同甲烷氧化菌对氯代烃降解进行了探索，主要包括混合菌和纯菌株，所研究的污染物也不再局限于某一种氯代物。1986年，Fogel等[29]利用由泥沙中分离的混合甲烷氧化菌对TCE等6种氯代烯烃的降解进行了研究，利用同位素14C示踪等方法证明了甲烷氧化菌能够将氯代烃转化为CO2并能利用其合成自身生物质。1988年，Little等[30]利用仅以甲烷、乙醇为碳源的Ⅰ型甲烷氧化菌菌株46-1降解TCE并推测了其共代谢的降解机理及其降解产物。同年关于甲烷氧化菌降解氯代烃的第一个专利及随后利用混合菌株在反应器中降解卤代烃的专利申请成功[31]。

此后，Janssen等[32]也在同一年对比了混合菌株与两种纯菌甲基单胞菌Methylomonas methanicaNCIB11130和M. trichosporiumOB3b对7种氯代烃的降解。研究发现分离的纯菌与混合菌相比并无明显差异，说明氯代烃的降解只是甲烷氧化菌的作用。研究者也先后对甲基孢囊菌Methylocystissp. strain M降解TCE做了研究[33-35]，然而Uchiyama等[34]发现纯化前的混合菌株MU-81与纯菌株Methylocystissp. strain M对TCE的降解有明显的区别 (混合菌株有时能将TCE全部降解，而纯菌株不能)，进一步分离发现了一种非自养菌strain DA4，进而证明了该菌株在甲烷氧化菌降解氯代烃过程中起着重要的作用。以上研究表明混合菌中非甲烷氧化菌的种类繁多，而且这些菌在降解氯代烃过程中的作用有很大差异。

之前的大多数研究都停留在实验室层面，但环境中氯代烃污染存在污染范围广、面积不集中的特点[2,36-37]，这就对不改变环境条件、不转移污染沉积物的原位生物修复技术提出了新的需求[25]。Semprini等[38]研究了含水土层中氯代烃的原位生物降解，发现灌注富含甲烷和氧气的地下水可提高土著甲烷氧化菌活性，有效促进氯代烃的降解。

1.2 MMO催化氯代烃降解的研究

两种MMO如何催化氯代烃氧化及其活性的差异是长期困扰研究者的问题。研究表明，菌体生长在高浓度铜离子条件下，MMO的还原型辅酶 (NADH) 会受到抑制，Ⅱ型甲烷氧化菌中的sMMO在较低浓度铜离子时才能表达[9,39]，而pMMO几乎存在于所有的甲烷氧化菌中，但sMMO似乎比pMMO有更广泛的特异性。大量关于sMMO的研究已经通过M. trichosporiumOB3b展开，纯sMMO比其他混合或纯菌株对TCE的降解速率高出至少一个数量级，这说明它在生物降解领域中有较广泛的应用潜力[27]。

Anderson等[9]利用表达pMMO的混合甲烷氧化菌对氯乙烯 (Vinyl chloride, VC) 等5种氯代烯烃的降解做了研究，发现顺-1,2-二氯乙烯(cis-1,2-Dichloroethylene, c-1,2-DCE) 、TCE和1,1-二氯乙烯 (1,1-Dichloroethylene, 1,1-DCE)的降解率远小于表达sMMO的菌株，但反-1,2-二氯乙烯 (trans-1,2-Dichloroethylene, c-1,2-DCE)和VC的降解量是所报道表达sMMO细胞的20倍，这说明同一种酶对不同底物的亲和力差别较大。Oldenhuis等[7]、Tsien等[40]、Fox等[41]和Jahng等[42]利用纯菌株M. trichosporiumOB3b或由其纯化的sMMO对TCE在内的氯代烃进行降解研究，结果都显示氯代烃的降解是sMMO的作用，该酶的降解能力远高于其他能降解TCE的酶。

尽管sMMO对许多氯代烃有高效的催化氧化作用，但sMMO在氯代烃和甲烷之间强烈的竞争性抑制和smmo基因位点表达易受环境影响等原因限制了该类菌体的应用。Jahng等[42]利用基因重组技术对重组菌株降解氯代烃做了研究，该菌株降解TCE过程不存在竞争性抑制，因而利用基因工程有望实现生物降解污染物的新突破。Lee等[43]发现表达pMMO甲烷氧化菌较sMMO菌株有更高的生长速率，一些不同浓度氯代烃能影响 (促进或抑制) 酶的活性和细胞的生长。这些发现都表明对于污染物的降解，MMO的结构和菌体生长的相对速率是重要的影响因素。

Phelps等[44]分离了一株能够产生pMMO并能结构性表达sMMO的M. trichosporiumOB3b变体菌株，其对TCE的降解速率是野生菌株的两倍。Koh等[45]分离得到了第一个已知能表达sMMO的Ⅰ型甲烷氧化菌Methylomonas methanica68-1，该菌株能降解萘 (Naphthalene) 和TCE，其活性比相同条件下M. trichosporiumOB3b中的高，但对TCE的亲和性小于M. trichosporiumOB3b (分别为(40±3) μmol/L和(126±8) μmol/L)，利用基因探针基因组示踪和印迹杂交分析显示两种菌株内的sMMO几乎没有同源性。以上研究表明sMMO在自然界中发展是多样的。

sMMO催化氧化的范围非常广泛，包括烷烃的羟基化，烯烃、醚类、氯代烷烃的环氧化等[46-48]，但在实际应用过程中，菌体降解范围、菌株的生长效率、生物转化的产物、酶的稳定性及基因的表达规律等都是重要的影响因素。

1.3 氯代烃降解动力学概述与模型菌株的降解动力学分析

1.3.1 氯代烃降解动力学概述

在确定了一些甲烷氧化菌能够降解氯代烃后，研究者着手对其降解动力学进行研究以实现氯代污染物的调控和生物降解。Strand等[49]在封闭的反应器中研究了TCE、TCA降解动力学。结果显示两种氯代烃浓度小于3 000 μg/L时，其降解均符合一级动力学；通过提供底物(甲烷) 与否及改变氯代烃浓度所得结果证明该生物降解过程中底物之间存在竞争性抑制且动力学研究存在一定的底物浓度范围。

随后Arvin[50]利用含有由氯代烃污染水体分离的混合甲烷氧化菌的生物膜反应器探究了TCE等4种氯代烃的降解动力学，当氯代烃浓度在0−1.0 mg/L时，降解均符合一级动力学；Broholm等[51]首次利用混合菌株提出并验证了底物竞争性抑制，以不同初始浓度的TCE(50−4 300 μg/L)和甲烷(0.53−3.2 mg/L)模拟了降解模型，该模型的建立为甲烷氧化菌降解TCE的研究及原位生物修复的工程设计提供了一定的理论指导。

由于在生长底物和共代谢底物之间存在着竞争性抑制，所以确定最适底物比例至关重要。Herbst[52]以TCE降解为例建立了生长底物、共代谢底物和氯代物降解率之间的三维曲面 (图1)。当TCE浓度为7.5 mg/L时，最佳TCE的降解率处在较为狭小的区域，所以在降解研究过程中氯代烃的降解率通常较低。

图1 TCE和底物浓度与其降解率的关系[31]Fig. 1 Dependence of the TCE degradation rate on substrate and co-metabolic substrate concentration[31].

1.3.2 菌株M. trichosporium OB3b降解氯代烃动力学概述与分析

本文总结了模型菌株M. trichosporiumOB3b对多种氯代烃的降解动力学参数，如表1所示。Oldenhuis等[53]研究了M. trichosporiumOB3b对TCE等7种氯代烃的降解动力学，结果表明CF、t-1,2-DCE和TCE为易降解化合物，1,2-二氯乙烷 (1,2-Dichloroethane, 1,2-DCA)、TCA和1,1-DCE为难降解化合物，说明该菌株对不同氯代烃的亲和性差异较大，并认为sMMO与CF的亲和性最大。

Van Hylckama等[12]利用自动进样装置研究了TCE和CF等8种氯代烃的降解动力学常数，并取得了与Speitel等[11]一致的结果。TCE速率常数(0.5−3.31 mg/d) 是 CF(0.2−0.4 mg/d)的 2.5−11倍，并且甲烷存在时有严重的酶竞争性抑制存在，但有的研究结果显示 CF的降解速率高于TCE[53-55]。出现以上情况可能是降解动力学实验中检测分析和微生物培养条件的差异所造成的。

Fox等[41]通过额外添加生物酶研究了sMMO对氯代烃降解的动力学常数，结果显示TCE等氯代烃的降解速率提高了4−5个数量级，通过添加合成生物酶能够强化菌株在工程上的应用。Aziz等[56]和Fitch等[57]利用M. trichosporiumOB3b的变种菌株M. trichosporiumOB3b PP358对单一和混合氯代烃的降解动力学做了研究，该菌株对TCE等氯代烃的最大降解速率Vmax变化范围为3.1−24.8 mg/(mgcell·d)，半饱和常数KS的变化范围为1−10 mg/L。同时还发现有些二元氯代烃混 合 物 如 TCE (0.3−0.5 mg/L)和 c-1,2-DCE(<5 mg/L)等在降解过程无竞争性抑制。自然环境下的污染物是非单一性，为了使菌体实现工程上的应用，有必要建立合理的单一氯代烃，二元氯代烃甚至多元氯代烃降解动力学模型。

不同氯代烃的动力学常数相差较大，可以看出各氯代烃的半饱和速率常数KS，最高利用率Vmax和虚拟一阶速率常数ka的变化范围分别为0.34−28.6 mg/L ， 0.45−94.2 mg/(mgcell·d) 和0.16−11.52 L/(mg·d)。由于研究条件 (温度、培养条件、氯代烃浓度等) 的差异，可能会导致某一氯代烃降解动力学常数变化范围较大，如CF的Vmax最大值是最小值的33.6倍，ka变化了77.7倍；TCE在浓度0.026 3−32.9 mg/L范围内，Vmax变化了120倍。在动力学研究中，氯代烃的种类、结构、培养条件及菌株的类型等是重要的影响因素。

对比而言M. trichosporiumOB3b通常比混合菌的降解能力强。同时有研究表明氯化程度也影响氯代烃的相对速率常数，且随着氯化程度的增加菌株对氯代烷烃和氯代烯的降解能力(速率常数) 呈逐渐递减的趋势，二氯甲烷(Dichloromethane, DCM) 和 VC的降解速率常数在同等条件下通常较大，这与Semprini等[38]的研究结论一致。氯代烷烃的生物降解速率与氯代烯烃相比有很大的不同，氯代烯烃的最大利用率高于氯代烷烃，并且氯代烯烃的最大利用率随氯化程度的增加呈增大趋势，这也说明碳碳双键比单键更容易被降解 (图2)。

?

图2 烃的氯化程度对一阶速率常数Ka、最大利用率Vmax和半饱和常数Kc的影响Fig. 2 Impact of pseudo first-order rate constant, maximum utilization rate and half velocity constant on the extent of chlorinate. Where DCM, CF, 1,2-DCA and TCA are chloralkanes, and VC, 1,1-DCE, c-1,2-DCE, t-1,2-DCE and TCE are chloroalkenes.

2 兼性甲烷氧化菌降解氯代烃的研究进展

通过降解动力学能够判断污染物的降解是哪种MMO的作用，但是污染物与生长底物之间存在着复杂的酶竞争机制。尽管甲烷氧化菌有广泛的底物降解范围，但是甲烷在水溶液中的微溶性使得甲烷氧化菌作为介质的生物修复实现有了一定的难度。研究发现一些兼性甲烷氧化菌能利用多种碳源表达MMO，例如甲基细胞菌属Methylocella兼性甲烷氧化菌能优先利用乙酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸和乙醇等多碳化合物。这就使得在没有甲烷的条件下，利用甲烷氧化菌降解污染物成为了可能，从而有望克服MMO的底物竞争性抑制。

2.1 兼性甲烷氧化菌Methylocystis strain SB2降解氯代烃的研究现状

近几年来研究者们研究最多为变形菌纲(α-Proteobacteria) 兼 性 甲 烷 氧 化 菌Methylocystisstrain SB2，研究发现它能够结构性表达MMO，并且能够在乙酸或乙醇为底物的培养基中降解多种氯代烃类污染物[58-59]。Im等[58]利用不同底物 (甲烷和乙醇) 存在时该菌株降解氯代烃的结果表明氯代烃降解过程不影响该菌株生长，该降解过程是由于pMMO的作用，pMMO的竞争性抑制限制了菌株的生长和氯代烃的降解，且不同氯代烃的降解机理不同。

随后Yoon等[59]首先利用PCR和反转录PCR(RT-PCR) 技术证明在乙酸盐中pmoA的表达比在甲烷中减少了1−2个数量级，利用Methylocystisstrain SB2降解TCE等3种氯代烃的研究同样得到了Im等的结论。Jagadevan等[10]基于Methylocystisstrain SB2降解氯代烃的研究得到了两点重要的结论：1)Methylocystisstrain SB2在乙醇中生长时pMMO为非必需酶，乙醇能够作为一种选择性生长基质促进污染物的降解；2)Methylocystisstrain SB2能够利用乙醇增强污染物的转移和降解。

2.2 兼性甲烷氧化菌 Methylomicrobium album BG8降解氯代烃的研究现状

20世纪末，Han等[60-61]、和Lontoh等[6]对甲基微菌MethylomicrobiumalbumBG8降解氯代烃做了较为系统的研究，通过同位素示踪法对代谢产物进行了研究，针对降解过程探究了氯代烃的降解动力学。Han等[60]根据氯代烃降解程度及对菌体的毒性作用将其分为4类：1) 能够被降解对菌体毒性小；2) 能够被降解有强烈的毒性作用；3) 不能被降解对菌体毒性小；4) 不能被降解有强烈的毒性作用。Oldenhuis等[53]详细研究了TCE对细胞毒性作用，发现细胞的失活程度与TCE的降解量成正比，并证实细胞失活是由于降解产物与细胞蛋白质共价键的非特异性结合。Han等[61]研究表明一氯甲烷 (Chloromethane)能够作为该菌体碳源促进其在甲醇中生长，并得到其表观速率常数ka和最大降解率Vmax分别为(11±3) μmol/L 和 (15±0.6) nmol/(mgcell·min)。Lontoh等[6]将荚膜甲基球菌MethylococcuscapsulatusBath中纯化的pMMO用于TCE降解研究，结果表明TCE能被pMMO降解为CO2，通过乙炔致失活原理证明MethylomicrobiumalbumBG8中pMMO是氯代物氧化的活性物，并提出了TCE降解途径：TCE首先转化为环氧化合物，而后通过自发化学反应释放HCl变为乙醛酸盐，其在pMMO的作用下氧化为甲酸盐和二氧化碳。图3为Alvarez-Cohen等[55]提出的MMO催化氧化CF和TCE过程。

2.3 矿化垃圾中兼性甲烷氧化菌筛选与氯代烃耐受性研究

2009年，Zhao等[62]分离得到了一株兼性甲烷氧化菌Methylocystisstrain JTA1。它能提高矿化垃圾生物覆盖层甲烷氧化能力，也对TCE、CF等氯代烃具有较高耐受性。由图4可知，在低浓度CF (20−50 mg/L)条件下，菌株显示了较高的甲烷氧化活性；此外，与活性细胞 (Growing cell) 相比，菌株JTA1的静息细胞 (Resting cell)对TCE和CF有更强的降解活性[62]，这与M. trichosporiumOB3b在静息细胞状态下能够完全降解CF[41]的结果一致。同时，利用由矿化垃圾中富集的甲烷氧化菌群研究了其静息细胞对TCE的共代谢降解，以Monod模型为基础进行了降解动力学推演[63]，结果如图5所示。当TCE初始浓度为45.5 mg/L，菌体浓度Cx为1.728 g/L时，降解率为79%。降解TCE的动力学符合Monod模型。通过拟合得到最大比消耗速率qs,max为1.51×10–4min–1、半 饱 和 常数KS为2.58 mg/L(R2=0.961)。KS小于M. trichosporiumOB3b，说明该菌群对TCE有较强的亲和力。以上研究有效的扩展了兼性甲烷氧化菌的应用领域，开展基于兼性甲烷氧化菌的深入系统研究，有望在氯代烃生物降解的工程应用领域取得新的突破。

图3 MMO催化降解TCE和CF过程[55]Fig. 3 The process of degradation of TCE and CF by MMO[55].

图4 Methylocystis strain JTA1对不同浓度CF的耐受性[62]Fig. 4 Chloroform tolerance of Methylocystis strain JTA1 at different concentrations of chloroform[62].

2.4 兼性甲烷氧化菌中pMMO的催化特性及其应用潜力

pMMO和sMMO不仅在细胞中存在方式不同，而且它们对抑制剂的敏感程度也有差别，pMMO包含有更多敏感的酶[64]。与sMMO相比pMMO的底物范围较小，降解速度较慢，所以早期的研究主要针对表达sMMO的细胞且多数只有一种甲烷氧化菌和单一污染物的简单系统。在复杂原位自然环境下，表达pMMO的菌株在普遍化氯乙烯类污染物中更容易存活[43]，并且能够氧化除环状和芳香烃外长度高达5个碳原子以上的烷烃和烯烃[27,46,65]，有研究显示pMMO对碳的利用率比sMMO高38%[66]，这表明在利用表达pMMO的兼性甲烷氧化菌降解氯代物时有了较为广泛的碳源，同时通过添加像乙醇类的多碳化合物克服由于甲烷的微溶性对菌体生长的影响也成为了可能，这使得越来越多的研究逐渐青睐于pMMO。研究者们利用乙醇原位注入到被TCE和四氯乙烯污染的水中强化甲烷氧化菌对污染物的降解，并验证了其可行性[67-68]。Lee等[43]和Yoon等[69]利用“△模型”预测了sMMO和pMMO的表达，结果显示表达pMMO的甲烷氧化菌选择的氯代烃浓度范围超过sMMO的细胞。所以能够利用多碳化合物的兼性甲烷氧化菌比专一甲烷氧化菌在降解氯代烃上有更强的优势。

图5 甲烷氧化菌群对TCE降解曲线和以Monod方程为基础的降解动力学拟合[63]Fig. 5 Degradation curve of TCE by methanotrophs and degradation kinetics of TCE based on Monod equation[63].Where Cx, rsL and CS are dry weight of the strain, average degradation rate of TCE in the interval time of measure and concentrations of TCE respectively.

兼性甲烷氧化菌降解污染物时能够合成自身的生物质。早期的研究中没有对这种现象给出一个较为合理的解释，研究中发现，在甲醇为底物的培养基中一氯甲烷能够刺激甲烷氧化菌的生长[28]。但兼性甲烷氧化菌同化多碳化合物的途径仍然是不清楚的，迄今为止所有已确认的兼性甲烷氧化菌都是α-Proteobacteria，都是通过丝氨酸途径从甲醛中对碳同化，氧化乙酸盐过程产生的苹果酸和乙醛酸盐是丝氨酸循环的中间体[8,41]，且乙醛酸盐是表达pMMO的细胞和纯sMMO氧化TCE的初级产物[25]，这表明，兼性甲烷氧化菌和甲烷氧化菌利用丝氨酸循环进行碳同化作用。

3 甲烷氧化菌降解氯代烃现存问题及未来发展方向

近20年来，利用甲烷氧化菌在氯代烃类污染物生物降解中的应用取得了许多实质性的进展，这主要包括反应器规模的氯代烃类污染物生物修复[14,57,70-78]和原位实地污染物的生物移除[13,38,79-81]。生物反应器分为基质、菌体生长及污染物的降解发生在同一空间的单级反应器和菌体生长与污染物降解发生在不同位置的多级反应器。多级反应器的最大优势是避免了生长基质和污染物之间对MMO的竞争性抑制，从而提高了污染物的降解能力。原位生物修复的关键步骤是通过添加安全廉价的碳源、氮源等对本土甲烷氧化菌的生物刺激从而增强其对污染物的共代谢降解能力。该研究在土壤和废水污染物的生物移除等领域具有一定的应用潜力和实用价值。

尽管甲烷氧化菌在氯代污染物的生物降解方面展示了广泛的应用前景，但能够降解氯代污染物且较易控制生物活动的甲烷氧化菌菌株的数量较少，在分子水平上对甲烷氧化菌的研究还并不完善。另外，由于专一营养甲烷氧化菌仅能以甲烷或甲基化合物为碳源，这就使得菌体富集和扩大培养手段难于在工程上应用。而兼性甲烷氧化菌降解氯代烃过程存在着生长底物和氯代烃、氯代污染物之间的竞争抑制[49,55-56]，污染物及共代谢产物的毒性也会引起菌体活性及转化效率的降低[41,82]。

未来研究中，首先应广泛地利用高通量测序和宏基因组分析等先进的基因工程手段确定兼性甲烷氧化菌在不同地域的丰度和分布。目前，兼性甲烷氧化菌的研究才刚刚起步，国内外公开的兼性甲烷氧化菌株还不超过10个[8,83]，更多新菌的分离纯化和生物特性都亟待研究。其次，应更深入地开展氯代烃降解的动力学研究，包括菌体细胞生长动力学、氯代烃降解动力学和共代谢底物抑制动力学等，通过推演动力学参数，揭示氯代烃以及其他氯代有机污染物的降解机制。在此基础上，开发新型生物反应器和菌株的扩培强化也是保证工程应用的关键。这些研究不仅能够促进甲烷氧化菌在污染物降解领域的应用，而且还能指导其他降解氯代烃污染物的甲基营养菌研究。相关研究成果也将成为甲烷氧化菌工程应用的重要理论和工艺基础。

[1]Nizzetto L, Macleod M, Borgå K, et al. Past,present, and future controls on levels of persistent organic pollutants in the global environment.Environ Sci Technol, 2010, 44(17)： 6526–6531.

[2]Yuan D, Yang D, Wade TL, et al. Status of persistent organic pollutants in the sediment from several estuaries in China. Environ Pollut, 2001,114(1)： 101–111.

[3]Cappelletti M, Frascari D, Zannoni D, et al.Microbial degradation of chloroform. Appl MicrobiolBiotechnol, 2012, 96(6)： 1395–1409.

[4]DiSpirito AA, Gulledge J, Shiemke AK, et al.Trichloroethylene oxidation by the membrane-associated methane monooxygenase in type I, type II and type X methanotrophs.Biodegradation, 1991, 2(3)： 151–164.

[5]Lontoh S, Semrau JD. Methane and trichloroethylene degradation byMethylosinus trichosporiumOB3b expressing particulate methane monooxygenase. Appl Environ Microbiol,1998, 64(3)： 1106–1114.

[6]Lontoh S, Zahn JA, DiSpirito AA, et al.Identification of intermediates ofin vivotrichloroethylene oxidation by the membrane-associated methane monooxygenase.FEMS Microbiol Lett, 2000, 186(1)： 109–113.

[7]Oldenhuis R, Vink R, Janssen DB, et al.Degradation of chlorinated aliphatic hydrocarbons byMethylosinus trichosporiumOB3b expressing soluble methane monooxygenase. Appl Environ Microbiol, 1989, 55(11)： 2819–2826.

[8]Semrau JD, DiSpirito AA, Vuilleumier S.Facultative methanotrophy： false leads, true results,and suggestions for future research. FEMS Microbiol Lett, 2011, 323(1)： 1–12.

[9]Anderson JE, McCarty PL. Transformation yields of chlorinated ethenes by a methanotrophic mixed culture expressing particulate methane monooxygenase. Appl Environ Microbiol, 1997,63(2)： 687–693.

[10]Jagadevan S, Semrau JD. Priority pollutant degradation by the facultative methanotroph,Methylocystis strain SB2. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(11)： 5089–5096.

[11]Speitel Jr GE, Thompson RC, Weissman D.Biodegradation kinetics ofMethylosinus trichosporiumOB3b at low concentrations of chloroform in the presence and absence of enzyme competition by methane. Water Res, 1993, 27(1)：15–24.

[12]Van Hylckama VJ, De Koning W, Janssen DB.Transformation kinetics of chlorinated ethenes byMethylosinus trichosporiumOB3b and detection of unstable epoxides by on-line gas chromatography.Appl Microbiol Biotechnol, 1996, 62(9)： 3304–3312.

[13]Brockman F, Payne W, Workman D, et al. Effect of gaseous nitrogen and phosphorus injection onin situbioremediation of a trichloroethylene-contaminated site. J Hazard Mater, 1995, 41(2)： 287–298.

[14]Kumar A, Vercruyssen A, Dewulf J, et al. Removal of gaseous trichloroethylene (TCE) in a composite membrane biofilm reactor. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng, 2012, 47(7)：1046–1052.

[15]Dedysh SN, Knief C, Dunfield PF.Methylocellaspecies are facultatively methanotrophic. J Bacteriol, 2005, 187(13)： 4665–4670.

[16]Lee JH, Kim TG, Cho KS. Isolation and characterization of a facultative methanotroph degrading malodor-causing volatile sulfur compounds. J Hazard Mater, 2012, 235： 224–229.

[17]Belova SE, Baani M, Suzina NE, et al. Acetate utilization as a survival strategy of peat-inhabitingMethylocystisspp.. Environ Microbiol Rep, 2011,3(1)： 36–46.

[18]Dedysh SN, Panikov NS, Liesack W, et al.Isolation of acidophilic methane-oxidizing bacteria from northern peat wetlands. Science, 1998,282(5387)： 281–284.

[19]Dunfield PF.Methylocella silvestrissp. nov., a novel methanotroph isolated from an acidic forest cambisol. Int J Syst Evol Microbiol, 2003, 53(5)：1231–1239.

[20]Zhao TT, Xing ZL, Zhang LJ. Research progress and discovery process of facultative methanotrophs—a review. Acta Microbiol Sin,2013, 53(8)： 781–789 (in Chinese).

赵天涛, 邢志林, 张丽杰. 兼性甲烷氧化菌的发现历程. 微生物学报, 2013, 53(8)： 781–789.

[21]Han B, Su T, Li X, et al. Research progresses of methanotrophs and methane monooxygenase. Chin J Biotech, 2008, 24(9)： 1511–1519 (in Chinese).

韩冰, 苏涛, 李信, 等. 甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的研究进展. 生物工程学报, 2008, 24(9)：1511–1519.

[22]Wei SZ. Methanotrophs and their applications in environment treatment： a review. Chin J Appl Ecol,2012, 23(8)： 2309–2318 (in Chinese).

魏素珍. 甲烷氧化菌及其在环境治理中的应用.中国应用生态学报, 2012, 23(8)： 2309–2318.

[23]Bao LJ, Zhang YB, Wu HZ, et al. Research progress of biodegradation of halogenated organic compound. Chin J Health Lab Technol, 2002,12(3)： 376–380 (in Chinese).

鲍伦军, 张远标, 吴宏中, 等. 卤代有机物生物降解研究进展. 中国卫生检验杂志, 2002, 12(3)：376–380.

[24]Jiang H, Chen Y, Jiang P, et al. Methanotrophs：Multifunctional bacteria with promising applications in environmental bioengineering.Biochem Eng J, 2010, 49(3)： 277–288.

[25]Brigmon RL. Methanotrophic bacteria： use in bioremediation. Encyclopedia Environ Microbl,2001： 1936–1944.

[26]Semrau JD. Bioremediation via methanotrophy：overview of recent findings and suggestions for future research. Front Microbiol, 2011, 2(209)：1–7.

[27]Sullivan JP, Dickinson D, Chase HA.Methanotrophs,Methylosinus trichosporiumOB3b,sMMO, and their application to bioremediation.Crit Rev Microbiol, 1998, 24(4)： 335–373.

[28]Wilson JT, Wilson BH. Biotransformation of trichloroethylene in soil. Appl Environ Microbiol,1985, 49(1)： 242–243.

[29]Fogel MM, Taddeo AR, Fogel S. Biodegradation of chlorinated ethenes by a methane-utilizing mixed culture. Appl Environ Microbiol, 1986, 51(4)：720–724.

[30]Little CD, Palumbo AV, Herbes SE, et al.Trichloroethylene biodegradation by a methane-oxidizing bacterium. Appl Environ Microbiol, 1988, 54(4)： 951–956.

[31]Wendlandt KD, Stottmeister U, Helm J, et al. The potential of methane-oxidizing bacteria for applications in environmental biotechnology. Eng Life Sci, 2010, 10(2)： 87–102.

[32]Janssen DB, Grobben G, Hoekstra R, et al.Degradation of trans-1,2-dichloroethene by mixed and pure cultures of methanotrophic bacteria. Appl MicrobiolBiotechnol, 1988, 29(4)： 392–399.

[33]Nakajima T, Hiroo UI, Yagi TO, et al. Purif i cation and properties of a soluble methane monooxygenase fromMethylocystissp. M. Biosci Biotech Biochem, 1992, 56(5)： 736–740.

[34]Uchiyama H, Nakajima T, Yagi O, et al. Role of heterotrophic bacteria in complete mineralization of trichloroethylene byMethylocystissp. strain M.Appl Environ Microbiol, 1992, 58(9)： 3067–3071.

[35]Uchiyama H, Nakajima T, Yagi O, et al. Aerobic degradation of trichloroethylene by a new type II methane-utilizing bacterium, strain M. Agric Biol Chem, 1989, 53(11)： 2903–2907.

[36]Chen CB, Yang Q, Shen ZL. Research progress of bioremediation of TCE in underground water. J East Chin Geo Ins, 2003, 26(1)： 10–14 (in Chinese).

陈翠柏, 杨琦, 沈照理. 地下水三氯乙烯 (TCE)生物修复的研究进展. 华东地质学院学报, 2003,26(1)： 10–14.

[37]Wei CH, Zhang XX, Ren Y, et al. Pollution control of persistent organic pollutants, in water system：adsorption/enrichment, biodegradation and process analysis. Environ Chem, 2011, 30(1)： 300–309 (in Chinese).

韦朝海, 张小璇, 任源, 等. 持久性有机污染物的水污染控制： 吸附富集, 生物降解与过程分析.环境化学, 2011, 30(1)： 300–309.

[38]Semprini L, Roberts PV, Hopkins GD, et al. A field evaluation ofin-situbiodegradation of chlorinated ethenes： part 2, results of biostimulation and biotransformation experiments. Groundwater, 1990,28(5)： 715–727.

[39]Alvarez-Cohen L, McCarty P, Boulygina E, et al.Characterization of a methane-utilizing bacterium from a bacterial consortium that rapidly degrades trichloroethylene and chloroform. Appl Environ Microbiol, 1992, 58(6)： 1886–1893.

[40]Tsien HC, Brusseau GA, Hanson RS, et al.Biodegradation of trichloroethylene byMethylosinus trichosporiumOB3b. Appl Environ Microbiol, 1989, 55(12)： 3155–3161.

[41]Fox BG, Borneman JG, Wackett LP, et al.Haloalkene oxidation by the soluble methane monooxygenase fromMethylosinus trichosporiumOB3b： mechanistic and environmental implications.Biochemistry, 1990, 29(27)： 6419–6427.

[42]Jahng D, Wood TK. Trichloroethylene and chloroform degradation by a recombinant pseudomonad expressing soluble methane monooxygenase fromMethylosinus trichosporiumOB3b. Appl Environ Microbiol, 1994, 60(7)：2473–2482.

[43]Lee SW, Keeney DR, Lim DH, et al. Mixed pollutant degradation byMethylosinus trichosporiumOB3b expressing either soluble or particulate methane monooxygenase： can the tortoise beat the hare? Appl Environ Microbiol,2006, 72(12)： 7503–7509.

[44]Phelps PA, Agarwal SK, Speitel GE, et al.Methylosinus trichosporiumOB3b mutants having constitutive expression of soluble methane monooxygenase in the presence of high levels of copper. Appl Environ Microbiol, 1992, 58(11)：3701–3708.

[45]Koh SC, Bowman JP, Sayler GS. Soluble methane monooxygenase production and trichloroethylene degradation by a type I methanotroph,Methylomonasmethanica 68-1. Appl Environ Microbiol, 1993, 59(4)： 960–967.

[46]Brusseau GA, Tsien HC, Hanson RS, et al.Optimization of trichloroethylene oxidation by methanotrophs and the use of a colorimetric assay to detect soluble methane monooxygenase activity.Biodegradation, 1990, 1(1)： 19–29.

[47]Nazaries L, Murrell JC, Millard P, et al. Methane,microbes and models： fundamental understanding of the soil methane cycle for future predictions.Environ Microbiol, 2013, 15(9)： 2395–2417.

[48]Green J, Dalton H. Protein B of soluble methane monooxygenase fromMethylococcus capsulatus(Bath). A novel regulatory protein of enzyme activity. J Biol Chem, 1985, 260(29)： 15795–15801.

[49]Strand S, Bjelland M, Stensel H. Kinetics of chlorinated hydrocarbon degradation by suspended cultures of methane-oxidizing bacteria. J Water Pollut Control Fed, 1990, 62(2)： 124–129.

[50]Arvin E. Biodegradation kinetics of chlorinated aliphatic hydrocarbons with methane oxidizing bacteria in an aerobic fixed biofilm reactor. Water Res, 1991, 25(7)： 873–881.

[51]Broholm K, Christensen TH, Jensen BK. Modelling TCE degradation by a mixed culture of methane-oxidizing bacteria. Water Res, 1992,26(9)： 1177–1185.

[52]Herbst B. Biologischer Abbau von dichlormethan und dichlorethan durch mischkulturen im wirbelschichtreaktor. Ph.D. Berlin： TU Berlin, 1995.

[53]Oldenhuis R, Oedzes JY, Vander WJ, et al.Kinetics of chlorinated hydrocarbon degradation byMethylosinus trichosporiumOB3b and toxicity of trichloroethylene. Appl Environ Microbiol, 1991,57(1)： 7–14.

[54]Kim J, Lee WB. The development of a prediction model for the kinetic constant of chlorinated aliphatic hydrocarbons. Environ Model Assess,2007, 14(1)： 93–100.

[55]Alvarez-Cohen L, Mccarty PL. Product toxicity and cometabolic competitive inhibition modeling of chloroform and trichloroethylene transformation by methanotrophic resting cells. Appl Environ Microbiol, 1991, 57(4)： 1031–1037.

[56]Aziz C, Georgiou G, Speitel G. Cometabolism of chlorinated solvents and binary chlorinated solvent mixtures usingM. trichosporiumOB3b PP358.Biotechnol Bioeng, 1999, 65(1)： 100–107.

[57]Fitch MW, Weissman D, Phelps P, et al.Trichloroethylene degradation byMethylosinus trichosporiumOB3b mutants in a sequencing biofilm reactor. Water Res, 1996, 30(11)：2655–2664.

[58]Im J, Semrau JD. Pollutant degradation by aMethylocystisstrain SB2 grown on ethanol：bioremediation via facultative methanotrophy.FEMS Microbiol Lett, 2011, 318(2)： 137–142.

[59]Yoon S, Im J, Bandow N, et al. Constitutive expression of pMMO byMethylocystisstrain SB2 when grown on multi-carbon substrates： implications for biodegradation of chlorinated ethenes. Environ Microbiol Rep, 2011, 3(2)： 182–188.

[60]Han JI, Lontoh S, Semrau JD. Degradation of chlorinated and brominated hydrocarbons byMethylomicrobiumalbumBG8. Arch Microbiol,1999, 172(6)： 393–400.

[61]Han JI, Semrau JD. Chloromethane stimulates growth ofMethylomicrobium albumBG8 on methanol. FEMS Microbiol Lett, 2000, 187(1)：77–81.

[62]Zhao TT, Zhang L, Zhang Y, et al. Characterization ofMethylocystisstrain JTA1 isolated from aged refuse and its tolerance to chloroform. J Environ Sci (China), 2013, 25(4)： 770–775.

[63]Zhang LJ, Hu QM, Xing ZL, et al. Study on kinetics of co-metabolism degradation of TCE by methanotrophs community, J Chongqing Univ Technol： Nat Sci Ed, 2013, 10(27)： 30–35 (in Chinese).

张丽杰, 胡庆梅, 邢志林, 等. 甲烷氧化菌群共代谢降解 TCE的动力学研究. 重庆理工大学学报： 自然科学版, 2013, 10(27)： 30–35.

[64]Stanley S, Prior S, Leak D, et al. Copper stress underlies the fundamental change in intracellular location of methane mono-oxygenase in methane-oxidizing organisms： studies in batch and continuous cultures. Biotechnol Lett, 1983, 5(7)：487–492.

[65]Burrows KJ, Cornish A, Scott D, et al. Substrate specificities of the soluble and particulate methane mono-oxygenases ofMethylosinus trichosporiumOB3b. J Gen Microbiol, 1984, 130(12)： 3327–3333.

[66]Leak DJ, Dalton H. Growth yields of methanotrophs. Appl Microbiol Biotechnol, 1986,23(6)： 470–476.

[67]Ramakrishnan V, Ogram AV, Lindner AS. Impacts of co-solvent flushing on microbial populations capable of degrading trichloroethylene. Environ Health Perspect, 2005, 113(1)： 55–61.

[68]Taylor TP, Rathfelder KM, Pennell KD, et al.Effects of ethanol addition on micellar solubilization and plume migration during surfactant enhanced recovery of tetrachloroethene.J Contam Hydrol, 2004, 69(1)： 73–99.

[69]Yoon S, Semrau JD. Measurement and modeling of multiple substrate oxidation by methanotrophs at 20 ℃. FEMS Microbiol Lett, 2008, 287(2)： 156–162.

[70]Sang NN, Soda S, Ishigaki T, et al. Microorganisms in landfill bioreactors for accelerated stabilization of solid wastes. J Biosci Bioeng, 2012, 114(3)：243–250.

[71]Limbri H, Gunawan C, Rosche B, et al. Challenges to developing methane biofiltration for coal mine ventilation air： a review. Water Air Soil Pollut,2013, 224(6)： 1–15.

[72]Shimomura T, Suda F, Uchiyama H, et al.Biodegradation of trichloroethylene byMethylocystissp. strain M immobilized in gel beads in a fluidized-bed bioreactor. Water Res, 1997,31(9)： 2383–2386.

[73]Speitel GE, Leonard JM. A sequencing biofilm reactor for the treatment of chlorinated solvents using methanotrophs. Water Environ Res, 1992,64(5)： 712–719.

[74]Skouteris G, Hermosilla D, López P, et al.Anaerobic membrane bioreactors for wastewater treatment： a review. Chem Eng J, 2012, 198-199：138–148.

[75]Strand SE, Wodrich JV, Stensel HD.Biodegradation of chlorinated solvents in a sparged, methanotrophic biofilm reactor. J Water Pollut Control Fed, 1991, 63(6)： 859–867.

[76]Fernandez FE, Pinho I, Carballa M, et al.Biodegradation kinetic constants and sorption coefficients of micropollutants in membrane bioreactors. Biodegradation, 2013, 24(2)： 1–13.

[77]Walter GA, Strand SE, Herwig RP, et al.Trichloroethylene and methane feeding strategies to sustain degradation by methanotrophic enrichments.Water Environ Res, 1997, 69(6)： 1066–1074.

[78]Yu Y. Application of a methanotrophic immobilized soil bioreactor to trichloroethylene degradation[D].Kingston： Queen’s University, 2008.

[79]Eguchi M, Kitagawa M, Suzuki Y, et al. A field evaluation of in situ biodegradation of trichloroethylene through methane injection. Water Res, 2001, 35(9)： 2145–2152.

[80]Suttinun O, Luepromchai E, Müller R.Cometabolism of trichloroethylene： concepts,limitations and available strategies for sustained biodegradation. Rev Environ Sci Biotechnol, 2013,12(1)： 1–16.

[81]Braeckevelt M, Fischer AKästner M. Field applicability of Compound-Specific Isotope Analysis(CSIA) for characterization and quantification of in situ contaminant degradation in aquifers. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 94(6)： 1401–1421.

[82]Green J, Dalton H. Substrate specificity of soluble methane monooxygenase. Mechanistic implications.J Biol Chem, 1989, 264(30)： 17698–17703.

[83]Theisen AR, Murrell JC. Facultative methanotrophs revisited. J Bacteriol, 2005, 187(13)： 4303–4305.