不明原因性流产患者蜕膜组织液中Galectin-1变化初步研究

简江琰，余国丽

(资中县人民医院妇产科，四川资中641200)

·论著·

不明原因性流产患者蜕膜组织液中Galectin-1变化初步研究

简江琰，余国丽

(资中县人民医院妇产科，四川资中641200)

目的 通过检测半乳糖凝集素-1(Galectin-1)在不明原因性流产(UHA)患者蜕膜组织液中的表达及变化，探讨Galectin-1蛋白对胎盘形成的影响。方法选取2010年6月至2011年12月我科收治的流产患者40例以及正常非孕妇女志愿者20例为研究对象，其中以非孕妇女志愿者20例为A组，20例自愿要求人工流产的正常早孕妇女为B组，20例不明原因性流产患者为C组，分析三组受试对象的年龄、孕周、蜕膜组织液中Galectin-1蛋白表达、外周血中CD4+%、CD4+CD25+%、CD4+CD25+Foxp3+%变化。结果①B组与C组蜕膜组织液中Galectin-1表达均明显高于A组，B组Galectin-1表达明显高于C组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；②C组外周血中CD4+CD25+Foxp3+%显著低于B组(P＜0.05)，且CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比值低于A组和B组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论UHA患者蜕膜组织中Galectin-1表达下降，且外周血CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比值下降，两者均不利于胚胎发育，早期介入调节两者的异常表达有望成为治疗UHA的新途径，值得引起关注。

不明原因性流产；半乳糖凝聚素-1；蜕膜组织；免疫学机制

自然流产2次或2次以上即定为复发性流产，复发性流产的病因较为复杂，排除遗传、内分泌紊乱、解剖异常、感染等因素之后，仍然有40%～80%的发病原因不明，临床上常将其称为不明原因性流产(Unexplained habitual abortion，UHA)[1]。UHA的临床处理较为棘手，随着免疫学的发展，近些年临床相关研究更多注重于免疫学因素所致的自然流产。动物实验发现半乳糖凝聚素-1(Galectin-1)通过诱导T细胞凋亡、识别糖复合物等机制参与肺泡植入和维持整个妊娠过程，为胚胎的生长提供免疫抑制的环境[2]。本文通过检测正常非孕子宫内膜、UHA患者与正常早孕妇女的蜕膜组织液中Galectin-1的表达及变化，分析探讨妊娠年龄、孕周、蜕膜组织液中Galectin-1表达、外周血中CD4+%、CD4+CD25+%、CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比例是否与流产的发生有关，以此探索UHA的发生的免疫学机制，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料40例流产患者均来自我院生殖免疫科室，年龄22～38岁。A组为同期于本院宫腔镜检查子宫内膜并自愿参与本次调查的20例健康非孕妇女，既往无流产史，剔除遗传、内分泌异常、自身免疫性疾病及其他疾病。B组为同期因非意愿妊娠要求人工流产的20例正常早孕妇女，经检查排除内分泌、生殖系统解剖、感染及自身免疫性疾病史，且无先兆流产症状，经B超检查胚胎发育正常。C组为2011年6～12月期间就诊的20例UHA患者，均符合临床诊断。

1.2 样本采集及预处理采集标本所用的工具均要求相对无菌操作，A组的子宫内膜组织、B组和C组的蜕膜组织在离体20 min内用PBS冲洗，用4%多聚甲醛溶液固定，24 h后石蜡包埋，切片4 μm以备免疫组化染色用。

1.3 Galectin-1蛋白表达的检测上述组织切片经脱蜡、消化、微波抗原修复、封闭、加入一抗、二抗、DAB显色、苏木素复染、脱水、中性树胶封片，在显微镜下观察，以PBS代替一抗作空白对照，待检切片阳性结果为棕黄色。采用免疫组化染色法检测样本中Galectin-1蛋白，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 外周血中各亚细胞群相对含量的检测采集各组受检对象空腹肘中静脉血5 ml，0.1 ml肝素抗凝，标本采集后4 h内采用“三标记染色法”完成测定项目。采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，PBS液将细胞浓度调整为1×107/ml，2只洁净的流式管分别加入100 L细胞悬液，其中一管加入CD4-FITC抗体20 ml、CD25-APC抗体20 ml和20 ml抗人Foxp3-PE，混匀，另一管作为对照不加任何试剂，4℃避光孵育30 min，两管3 000 r/min离心5 min，弃去上清，用流式细胞仪检测，结果以荧光抗体染色阳性细胞百分率记录表示。

1.5 统计学方法应用SPSS17.0软件进行统计分析，所有计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

A组、B组和C组受试对象的平均年龄分别为(28.85±3.048)岁、(29.30±3.213)岁和(28.10±3.553)岁，其组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；B、C两组患者的平均孕期分别为(53.25±8.996)d和(59.95± 12.416)d，差异无统计学意义(P＞0.05)；B组和C组患者蜕膜组织液中Galectin-1表达水平明显高于A组(P＜0.05)，而B组患者Galectin-1表达水平明显高于C组(P＜0.05)。此外，C组患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+%明显低于B组(P＜0.05)，且CD4+CD25+Foxp3+/ CD4+显著低于A组和B两组(P＜0.05)，见表1。

表1 三组妇女的各项指标比较(±s)

表1 三组妇女的各项指标比较(±s)

注：B组与A组比较，aP＜0.05；C组与B组比较，bP＜0.05；C组与A组比较，cP＜0.05。

3 讨论

3.1 UHA发生的免疫学机制妊娠是一种同种移植现象，胚胎作为同种移植物在母体内存活直到分娩出母体，实际上正好反映了母体对胚胎的免疫耐受，UHA的发生与母胎免疫耐受失衡有关。胚胎着床及发育过程需要众多因素的共同参与，包括粘附分子、细胞因子等，任何一个因素的改变均可导致妊娠结局发生变化。早孕妇女体内存在着复杂的免疫调节机制，体现为免疫耐受中的抑制反应增强，而免疫排斥功能相对减弱，维持这种微妙的平衡状态可保护胚泡的正常着床及胚胎的正常发育。T细胞在机体免疫应答中发挥关节作用，CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)是具有独特免疫调节功能的T细胞亚群，其表达频率下降与UHA发病有关[3]。Treg细胞可抑制T细胞增殖和分泌细胞因子，防止机体发生自身免疫反应，Foxp3是CD4+CD25+Treg发育和维持功能的重要调节基因，外周血Foxp3表达降调可能参与自然流产。本实验中C组UHA患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+%显著低于B组，且CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比值低于A组、B组，也说明Foxp3的下降与不明原因流产有关。Th1/Th2细胞因子是CD4+T细胞分泌的两个不同细胞因子亚群，两者互相抑制，Th1细胞因子主导细胞免疫，对胚胎有免疫损伤作用，Th2主导体液免疫，对妊娠其免疫保护作用。自身免疫性疾病的发生Th1/Th2细胞相对失衡状态有关，母体蜕膜细胞的凋亡与增殖不断地进行组织结构改建，是为了适应胎儿的需要。动物实验研究发现，正常妊娠小鼠从孕早期开始，蜕膜细胞及子宫腺体上皮细胞即有少量凋亡细胞，其对维持正常妊娠有一定作用[4]。

3.2 Galectin-1基因与UHA的关系Galectin-1是第一个被发现的半乳凝素家族成员，具有高度保守的氨基酸基序编码的糖结构识别区域(Carbohydrate recognition domains，CRD)，已知其与肿瘤的生长、粘附及转移有关，在细胞的增殖、分化及凋亡等过程中举足轻重。Galectin-1参与T细胞内稳态，通过一系列机制与受体结合并启动多种信号的传导过程，抑制Th1细胞因子的产生，延缓炎性反应效应。孔紫靖等[5]研究提出，Galectin-1在小鼠沛泡植入时着床点子宫内膜表达增高。Galectin-1 mRNA和蛋白正常早孕绒毛组织及蜕膜组织中的表达随着孕周的增加而升高，Galectin-1在滋养细胞浸润和胎盘形成中可能起着重要作用[6]。Galectin-1在大多数免疫赦免组织中表达，包括胎盘、视网膜等组织，使这些组织具有抑制炎症并保护自身完整的功能。胚胎的正常生长有赖于一个合适的免疫抑制环境，通过早期干预Galectin-1的表达控制可处理免疫抑制异常所导致的不明原因性流产。本实验中，B组自愿流产妇女与C组UHA患者蜕膜组织液中Galectin-1表达均明显高于A组，说明Galectin-1的表达与妊娠有关，此外，B组Galectin-1表达明显高于C组，也表明Galectin-1的表达不足参与不正常妊娠，也提示Galectin-1在妊娠过程中的重要性。

3.3 展望目前UHA的免疫性治疗是建立在免疫学假说的基础上进行的经验性治疗，通过各种药物来作用于免疫学发病机制中的环节，使免疫反应朝着有利于妊娠维持的方向发展，临床已有采用主动免疫治疗方法[7]、淋巴疗法[8]等来治疗UHA，但效果仍有待临床大规模实验验证。对正常早孕及UHA患者蜕膜组织液分析发现，Galectin-1在早孕过程中的降表达是引起流产发生的重要因素，与此同时对UHA患者外周血中相关定量分析发现正常早孕与UHA患者的CD4+CD25+Foxp3+%差异有统计学意义，UHA患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+有明显降低，说明母体免疫抑制的平衡状态受到破坏，纠正这种失衡状态即有可能治疗UHA。本文尚属初期研究，有待进一步深入研究探讨Galectin-1下调与CD4+CD25+Foxp3+的相关性，以探求为UHA提供实验室诊断依据并探讨治疗途径的可能性，同时为指导UHA患者妊娠及改善妊娠结局提供参考价值。

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Preliminary study on the change of Galectin-1 expression in deciduas tissue of patients with unexplained habitual abortion.

JIAN Jiang-yan,YU Guo-li.Department of Gynecology and Obstetrics,People's Hospital of Zizhong County,Neijiang 641200,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo detect expression and change of Galectin-1 in deciduas tissue of patients with unexplained habitual abortion(UHA),and to explore the affect of Galectin-1 protein on the formation of placenta.MethodsSurvey was conducted from June 2010 to December 2011 with 40 patients of abortion and 20 normal non-pregnant female volunteers,which were divided into group A(20 normal non-pregnant female volunteers),group B(20 patients voluntarily requesting for artificial abortion),group C(20 patients of UHA).The maternal age,gestational weeks,expression of Galectin-1 protein in deciduas tissue,changes of CD4+%,CD4+CD25+%,CD4+CD25+Foxp3+% in peripheral blood were analyzed.Results(1)Galectin-1 expression in group B and group C were significantly higher than group A(P＜0.05),which was also significantly higher in group B than group C(P＜0.05).(2)Peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+%in group C was significantly lower than that in group B(P＜0.05),and CD4+CD25+Foxp3+/ CD4+ratios was significantly lower in group C than group A and group B(P＜0.05).ConclusionIn patients UHA, Galectin-1 expression in deciduas tissue decreases,and CD4+CD25+Foxp3+/CD4+ratio in peripheral blood declines,which are both not conducive to embryonic development.Early intervention to change the abnormal expression of Galectin-1 is expected to become a new way to treat UHA.

Unexplained habitual abortion(UHA);Galectin-1;Deciduas tissue;Immunological mechanisms

R714.21

A

1003—6350（2014）21—3177—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.21.1246

2014-04-21)

简江琰。E-mail：2877267859@qq.com