碳酸饮料对乳恒牙更替期牙齿健康的影响*

孙莲莲 李长春 姜忠敏 盛 凤 李艳霞 刘晓智△

碳酸饮料对乳恒牙更替期牙齿健康的影响*

孙莲莲1李长春1姜忠敏2盛 凤3李艳霞3刘晓智3△

目的 研究碳酸饮料对乳恒牙更替期牙齿健康的影响作用及机制。方法40颗犬牙釉质样本分别采用15 μL可口可乐（可口可乐组）、雪碧（雪碧组）、纯苏打水（苏打水组）和生理盐水（生理盐水组）浸泡，各10颗。测定处理后饮料中钙、磷溶出浓度；分离牙乳头干细胞，以添加可口可乐、雪碧、苏打水和生理盐水的条件培养基进行细胞培养，采用PCR法和Western blot法检测核因子-κB受体活化剂配体（RANKL）、骨保护素（OPG）和维生素D受体（VDR）的mRNA和蛋白表达水平。结果各组钙、磷溶出浓度（mmol/L）由高到低均依次为：雪碧组（3.679±0.114、0.089±0.008）、可口可乐组（2.217±0.109、0.036±0.005）、生理盐水组（0.021±0.004、0.009±0.001）和苏打水组（0.007± 0.001、0.002±0.000）。各组RANKL的mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义。苏打水组和生理盐水组OPG的mRNA和蛋白表达水平均高于可口可乐组和雪碧组（均P＜0.05），雪碧组与可口可乐组、生理盐水组与苏打水组间差异均无统计学意义。生理盐水组VDR的mRNA和蛋白表达水平低于可口可乐组和雪碧组，高于苏打水组（均P＜0.05）。结论碳酸饮料可能通过调控成骨相关基因表达及维生素D受体家族共同影响乳恒牙更替期的牙齿健康。

碳酸盐饮料；RANK配体；骨保护素；受体,骨化三醇；牙乳头干细胞，维生素D受体

乳恒牙更替期是儿童牙齿生长发育过程中的关键阶段，但目前人们对这一期间发生的一系列生理变化机制认识有限。探索儿童乳恒牙更替发生发展过程中的内在机制，发现日常饮食中潜在的危险因素，寻找针对性的治疗和预防措施至关重要。碳酸饮料因含有糖及酸性成分，长期饮用会使牙齿受到侵蚀，引起“酸蚀症”。儿童牙齿的牙釉质处于未成熟阶段，对抗酸腐蚀的能力较低，pH值在2.2～4.9间的大多数碳酸饮料可导致儿童牙齿的矿质和釉质流失，牙齿龋坏的概率大大增加[1]。本研究以牙乳头干细胞为对象，通过模拟儿童乳恒牙更替期碳酸饮料对乳恒牙的作用特点，探索其内部可能存在的调控机制，以及碳酸饮料对儿童发育期乳牙脱落及恒牙萌发、生长的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 胎牛血清（杭州四季青），DMEM/F12培养基、胰蛋白酶（美国Invitrogene公司）；可口可乐、雪碧、纯苏打水为市售合格产品；核因子-κB受体活化剂配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）多克隆抗体（美国Chemicon公司），骨保护素（osteoprotegerin，OPG）多克隆抗体及维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）。实验犬牙齿由当地农场提供。

1.2 犬牙釉质样本的制备 取新鲜拔除的犬下颌切牙48颗，去除牙根及牙髓组织，用无氟石英粉磨去釉质表面菌斑及色素，流水冲洗干净。经体视显微镜检查无裂痕、缺隙者共40颗，置于去离子水中，于-20℃冰箱中保存、备用。

1.3 饮料处理牙釉质后钙、磷浓度的测定 采用完全随机法将40颗犬牙分为可口可乐组、雪碧组、苏打水组和生理盐水组，各10颗。用0.5 mol/L的过氯酸酸蚀暴露的釉质面30 s，分别取15 μL可口可乐、雪碧、纯苏打水和生理盐水滴加于釉质面，于37℃处理牙釉质，5次/d，5 min/次，处理后的饮料收集于EP管中。处理间隙置于生理盐水中过夜。7 d后将收集的同一种饮料混合。每10 μL饮料加入280 μL的钙、磷反应液，振荡混匀后立即于自动微板读数仪，于630 nm处测定钙和磷的吸光度值（A），同期做标准曲线，计算钙、磷溶出浓度C浓度=（A-1.648）/137.36。

1.4 牙乳头干细胞的分离与培养 将来自犬上下颌的第二磨牙牙胚置于培养液中，完整分离牙乳头和成釉器，参照文献[2]进行乳头干细胞的分离与培养。

1.5 牙乳头干细胞在条件培养液中的培养 以可口可乐、雪碧、苏打水和生理盐水为添加剂，配制条件培养液进行牙乳头干细胞的培养。其他细胞培养方式同1.4。

1.6 聚合酶链式反应（PCR） 提取细胞总RNA，反转录酶转录后进行PCR循环反应。利用引物设计软件设计合成上游引物和下游引物序列。β-actin作为内参对照。反应条件：94℃预变性5 min，94℃45 s，60℃60 s，72℃90 s，30个循环，72℃延伸10 min。取15 μL反应物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观测并记录反应结果。RANKL上游引物：5′-GAGACTACGGCAAGTA-3′；下游引物：5′-CCTCCAACGTTTATGG-3′，扩增产物长度为822 bp。OPG上游引物：5′-TGGAGCTCGAATTCTGCTTG-3′；下游引物：5′-CATCAAGATGCGGAGC TGCT-3′，引物扩增产物长度为603 bp。VDR上游引物：5′-ACCCCCACTGAAAAAGATA-3′；下游引物：5′-CCGTGAATTCGCACCGCACAG-3′，扩增片段为306 bp。βactin上游引物：5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′；下游引物：5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGCA-3′，引物扩增产物长度为410 bp。

1.7 Western blot实验 参照文献[2]，采用Western blot检测RANKL、OPG和VDR的蛋白表达水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计处理，计量资料数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同碳酸饮料处理牙釉质对钙、磷溶出浓度的影响 各组钙、磷溶出浓度由高到低均依次为：雪碧组、可口可乐组、生理盐水组和苏打水组；组间多重比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

Table 1 Comparison of dissolution concentration of calcium and scale between all groups表1 各组钙、磷溶出浓度比较（mmol/L，n=10，±s）

Table 1 Comparison of dissolution concentration of calcium and scale between all groups表1 各组钙、磷溶出浓度比较（mmol/L，n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与可口可乐组比较，b与雪碧组比较，c与苏打水组比较，P＜0.05

组别可口可乐组雪碧组苏打水组生理盐水组F钙磷2.217±0.109 3.679±0.114a0.007±0.001ab0.021±0.004abc21.835＊＊0.036±0.005 0.089±0.008a0.002±0.000ab0.009±0.001abc15.664＊＊

2.2 碳酸饮料对RANKL、OPG和VDR mRNA表达的影响 各组RANKL mRNA的表达差异无统计学意义。苏打水组和生理盐水组OPG mRNA表达水平均高于可口可乐组和雪碧组（均P＜0.05），雪碧组与可口可乐组、生理盐水组与苏打水组间差异均无统计学意义。生理盐水组VDR mRNA表达水平低于可口可乐组和雪碧组，高于苏打水组（均P＜0.05），雪碧组与可口可乐组间差异无统计学意义，见图1。

2.3 碳酸饮料对RANKL、OPG和VDR蛋白表达的影响 各组RANKL蛋白的表达差异无统计学意义。苏打水组和生理盐水组OPG蛋白质表达水平均高于可口可乐组和雪碧组（均P＜0.05），雪碧组与可口可乐组、生理盐水组与苏打水组间差异均无统计学意义。生理盐水组VDR蛋白表达水平低于可口可乐组和雪碧组，高于苏打水组（均P＜0.05），雪碧组与可口可乐组间差异无统计学意义，见图2。

3 讨论

成骨细胞和破骨细胞在骨科领域被广泛研究，二者间的动态平衡影响儿童骨骼发育以及成人病理状态下的骨吸收与增殖异常[3]。RANKL又称为骨保护素配体及破骨细胞分化因子，在骨骼中的主要作用为刺激破骨细胞的分化和活性，抑制破骨细胞的凋亡。RANKL过表达可导致一系列骨疾病，如风湿性关节炎、银屑病性关节炎等[4]。OPG的主要作用是抑制破骨细胞的形成和活性，OPG治疗可预防骨质疏松和血管钙化及逆转骨质疏松[5]。乳恒牙更替是儿童牙齿生长发育的一个重要阶段，此阶段乳牙牙髓、牙周膜、牙槽骨以及继承恒牙胚等组织内均发生一系列变化，并需要有分化成熟的破骨细胞吸收乳牙根、牙槽骨等组织，为恒牙胚的发育和萌出开辟空间，使得乳恒牙实现顺利替换。基于以上理论，本研究以犬乳恒牙更替期饮用碳酸饮料的作用特点，研究破骨及成骨相关基因RANKL和OPG的表达变化，探索在上述基因间可能存在的网络调控机制，以及碳酸饮料可能在儿童发育期对乳牙脱落及恒牙萌发、生长的影响。

Figure 1 Effect of the carbonated drinks on mRNA、transcription of some genes图1各组RANKL、OPG和VDR的mRNA表达比较

Figure 2 Effect of the carbonated drinks on some protein expression图2 各组RANKL、OPG和VDR蛋白表达比较

可口可乐和雪碧为酸性饮料，纯苏打水为碱性溶液[6]。本研究结果显示，可口可乐组和雪碧组钙、磷溶出浓度均高于生理盐水组，苏打水组钙、磷溶出浓度低于生理盐水组，提示酸性碳酸饮料具有明显的脱钙与脱磷作用；而碱性饮料则表现出一定的钙、磷保护作用，可在一定程度上抑制上述反应。由于雪碧的pH值高于可口可乐[7]，但其脱钙与脱磷作用最为明显，提示酸碱度不是影响脱钙与脱磷作用的唯一因素。为进一步探索其可能存在的分子机制，本研究通过分离牙乳头干细胞，以添加3种饮料的条件培养基进行细胞培养，结果发现，3种饮料对RANKL基因的mRNA和蛋白水平均无影响；可口可乐和雪碧可降低OPG的表达水平，但纯苏打水对OPG基因的表达无明显影响。提示日常饮用的碳酸饮料几乎不会影响牙乳头干细胞中RANKL的功能，但酸性饮料可降低OPG的表达，进而影响成骨细胞与破骨细胞间的动态平衡。

由于在上述结果仅发现碳酸饮料可影响OPG的表达，但作用较轻微，笔者推测碳酸饮料可能通过其他机制共同影响儿童乳恒牙更替期的牙乳头干细胞的生长。因此本研究选择对钙、磷调节起重要作用的VDR为研究对象进行实验，结果表明可口可乐和雪碧可同时升高VDR基因的表达，纯苏打水则可明显降低VDR基因的表达水平。提示VDR可能在此调控过程中发挥了更为积极的作用，但其具体机制有待于进一步研究。

综上所述，碳酸饮料可能通过调控成骨相关基因表达及维生素D受体家族共同影响儿童乳恒牙更替期的牙齿健康。

[1]Liu H,Cao T.Dental application potential of mesenchymal stromal cells and embryonic stem cells[J].Chin J Dent Res,2010,13(2):95-103.

[2]李长春，孙莲莲，姜忠敏，等.1,25（OH）2D3在牙乳头干细胞成骨分化中的作用[J].天津医药，2014，42（5）：421-423.

[3]王晓春,于海燕,毕佳锐,等.基质金属蛋白酶在健康牙齿和龋齿成牙本质细胞中的表达[J].天津医药,2013,41(1):12-14.

[4]穆玉,陈乃玲,彭伟,等.羧甲基壳聚糖温敏凝胶对小鼠L929细胞增殖的影响[J].天津医药,2012,40(4):363-365,421.

[5]Petrovic V,Stefanovic V.Dental tissue-new source for stem cells [J].Scientific World Journal.2009,9:1167-1177.doi:10.1100/ tsw.2009.125.

[6]Ruparel NB,Teixeira FB,Ferraz CC,et al.Direct effect of intracanal medicaments on survival of stem cells of the apical papilla[J].J Endod,2012,38(10):1372-1375.doi:10.1016/j.joen.2012.06.018.

[7]Sedgley CM,Botero TM.Dental stem cells and their sources[J]. DentClin North Am,2012,56(3):549-561.doi:10.1016/j. cden.2012.05.004.

（2013-09-01收稿 2013-12-20修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Effect of Carbonated Drinks on Primary and Permanent Teeth Replacement in Children

SUN Lianlian1,LI Changchun1,JIANG Zhongmin2,SHENG Feng3,LI Yanxia3,LIU Xiaozhi3
1 Department of Stomatology,2 Department of Pathology,3 the Central Laboratory，the Fifth Central Hospital of Tianjin, Tianjin 300450,China

ObjectiveTo study the effect of carbonated drinks on primary and permanent teeth replacement in Children.Method Dog tooth enamel samples were soaked in coca-cola,sprite and pure soda,and the calcium,phosphorus level were analysed.Dental papilla stem cells were separated and cultured in the conditioned medium by adding three drinks. PCR and western blot were used to detect mRNA and protein levels of activator of nuclear factor-k B receptor ligand (RANKL),osteoprotegerin(OPG)and vitamin D receptor(VDR),then the possible role of each gene and interactions relationship were analyzed.ResultsCompared with saline,coca-cola and sprite showed their significantly decalcification and dephosphorization role,while plain soda water showed calcium and phosphorus protective effect.These three drinks had no effect on mRNA and protein levels of RANKL gene(P＞0.05).Coca-cola and sprite can reduce OPG mRNA and protein levels,and at the same time increase transcription and expression of the VDR gene.Plain soda water has no effect on the OPG gene manifestation,but can significantly reduce the transcription and translation level of the VDR gene.ConclusionCarbonated drinks may affect the dental health of the children's primary and permanent teeth replacement by regulating bone related gene expression and vitamin D receptor family.

carbonated beverages;RANK ligand;osteoprotegerin;receptors,calcitriol;dental papilla stem cells;vitamin D receptor

R788

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.015

*天津市卫生局科技基金项目（项目编号：2011KZ25）

1天津市第五中心医院口腔科(邮编300450),2病理科, 3中心实验室

△通讯作者 E-mail：lxz7997@126.com