强力霉素对胃癌细胞增殖及Notch1、MMP-9表达的影响*

许 敏 李 红

强力霉素对胃癌细胞增殖及Notch1、MMP-9表达的影响*

许 敏 李 红△

目的 研究强力霉素对胃癌细胞BGC-823细胞的增殖及Notch1、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表达的影响，为胃癌的治疗提供新的抗肿瘤药物。方法分别以0、5、10、20、40 mg/L终浓度的强力霉素作用于人胃癌细胞系BGC-823，运用MTT法检测细胞增殖程度；流式细胞仪检测细胞周期分布的影响；Western Blot检测Notch1、MMP-9蛋白水平的表达。结果强力霉素能够抑制人胃癌细胞BGC-823细胞的增殖，且有剂量及时间依赖性（P＜0.01）；强力霉素能够改变胃癌细胞BGC-823周期的分布，随着浓度的增加，S期所占比例降低；并且随着浓度的增加，Notch1的表达增强，MMP-9的表达降低（P＜0.01）。结论强力霉素能够抑制胃癌细胞BGC-823的增殖，促进Notch1上调为可能的机制之一。

胃肿瘤；细胞系,肿瘤；受体,Notch1；基质金属蛋白酶9；细胞增殖；细胞周期；强力霉素

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均较高，迫切需要寻找新的治疗方法。强力霉素是一种长效类四环素类抗生素，近年来发现强力霉素不但能够抑制细菌蛋白质的合成，还是基质金属蛋白酶（MMPs）的有效抑制剂，并且已经被应用于多种癌细胞的研究[1-2]。Notch信号通路作为一种进化保守的细胞间相互作用机制，在细胞的增殖和分化中起重要作用，与胃癌的发生发展有密切联系[3]。本研究观察强力霉素对人胃癌细胞系BGC-823细胞的增殖、细胞周期及Notch1、MMP-9表达的影响，初步探讨其可能的机制，为强力霉素治疗胃癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人胃癌细胞株（BGC-823）由北京大学郁卫东老师馈赠。实验根据强力霉素浓度不同分为5组，分别为空白对照组，药物终浓度为5、10、20、40 mg/L组。

1.2 主要试剂 强力霉素（sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），培养基（美国GiBico公司），青霉素、链霉素、胰蛋白酶（华美生物工程有限公司），Notch1抗体（ABCAM公司），MMP-9抗体（武汉博士德生物工程有限公司），二甲基亚砜（DMSO，Amresco公司），噻唑蓝（MTT，Amresco公司），PI染色液，70%乙醇，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 BGC-823细胞培养于含10%胎牛血清RPMI1640培养液中（100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素），在37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度孵箱内进行传代培养。

1.3.2 药物对细胞增殖作用的测定 采用MTT法。将细胞浓度调整为每孔细胞数为4×104，每孔200 μL，接种于96孔板，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。过夜后，分别加入含有不同浓度强力霉素的培养液，终浓度分别为5、10、20、40 mg/L，对照组加入相同体积的培养液，每一浓度设6个复孔，分别继续培养24、48、72 h。实验结束前4 h，每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，继续培养4 h后，吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡15 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上，以波长570 nm测定各孔吸光度（A）值。强力霉素对细胞生长的抑制率（IR）=（1-实验组A570nm/对照组A570nm）× 100%。以时间为横轴，抑制率为纵轴绘制生长曲线，观察强力霉素对BGC-823细胞增殖的影响。

1.3.3 细胞周期分布检测 取对数生长期细胞，以不同浓度强力霉素作用于细胞，对照组加入相同体积的培养液，培养48 h后，收集各组细胞，离心后PBS洗2遍，每管加入70%乙醇1 mL，将细胞轻轻吹起。4℃固定12 h，离心、弃固定液，用PBS重悬细胞后转入流式管，再次离心、弃上清，将每管中加入PI染色液，室温避光染色15 min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.3.4 Notch1和MMP-9蛋白表达测定 采用Western Blot法。以不同浓度强力霉素作用于细胞，对照组加入相同体积的培养液，培养48 h后，各组细胞中加入细胞裂解液RIPA，提取出细胞总蛋白，蛋白量根据Lowery法进行测定。以每个样品50 μg总蛋白的量准确点样，进行电泳，转膜。用含2%胎牛血清白蛋白（BSA）的Tris缓冲盐溶液（TBST）封闭2 h，加入一抗兔抗人Notch1 IgG（1∶1 000），兔抗人MMP-9 IgG（1∶100），4℃孵育过夜，用TBST洗膜3次，加入HRP标记的二抗羊抗兔IgG（1∶1 000），室温下水平摇动2 h，洗膜3次，用化学发光法（ECL）进行显色，曝光。以β-Actin抗体作为内参。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析及重复测量资料的方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，相关性比较采用Pearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 强力霉素对细胞增殖能力的影响 在一定范围内，不同浓度、不同时间的强力霉素组处理后均对胃癌细胞的生长起抑制作用，差异有统计学意义（F分组=22.050，F时间=617.376，F交互=40.552，均P＜0.001），且随着浓度的升高和作用时间的增强，其抑制作用加强，即强力霉素抑制胃癌细胞BGC-823呈时间、剂量依赖关系，见图1。

2.2 强力霉素对细胞周期的影响 强力霉素作用于胃癌细胞48 h后，5、10、20、40 mg/L组G0/G1期比例较对照组逐渐增加，而S期和G2/M期比例下降（P＜0.05）。强力霉素可将BGC-823细胞阻滞于G0/ G1期，抑制细胞进入S期和G2/M期，见表1。

Figure 1 The inhibitory effect of doxycycline on BGC-823 cell line图1 强力霉素对BGC-823细胞的抑制效应

Table 2 Effect of different concentrations of doxycycline on cell cycle distribution表1 不同浓度强力霉素作用48 h后细胞周期分布检测结果 （n=6，%±s）

Table 2 Effect of different concentrations of doxycycline on cell cycle distribution表1 不同浓度强力霉素作用48 h后细胞周期分布检测结果 （n=6，%±s）

＊＊P＜0.01；a与（1）组比较，b与（2）组比较，c与（3）组比较，d与（4）组比较，P＜0.05

组别对照组（1）强力霉素5 mg/L组（2）强力霉素10 mg/L组（3）强力霉素20 mg/L组（4）强力霉素40 mg/L组（5）F G0/G1期38.23±0.33 47.85±0.58a56.51±0.46ab62.25±0.57abc67.06±0.62abcd892.530＊＊S期31.56±0.41 24.83±0.62a18.46±0.48ab15.72±0.37abc12.37±0.56abcd949.002＊＊G2/M期30.21±0.61 27.32±0.57 25.03±0.66a22.03±0.61ab20.57±0.72abc139.190＊＊

2.3 Notch1和MMP-9蛋白表达 不同浓度强力霉素作用胃癌细胞48 h后，在一定范围内随着强力霉素浓度增加，Notch1的表达增强，MMP-9的表达降低，见表2、图2。Notch-1与MMP-9表达呈负相关（r=-0.994,P＜0.05）。

Table 2 The Expression of Notch1 and MMP-9表2Notch1和MMP-9蛋白表达结果（n=6±s）

Table 2 The Expression of Notch1 and MMP-9表2Notch1和MMP-9蛋白表达结果（n=6±s）

＊＊P＜0.01；a与（1）组比较，b与（2）组比较，c与（3）组比较，d与（4）组比较，P＜0.01

组别对照组（1）强力霉素5 mg/L组（2）强力霉素10 mg/L组（3）强力霉素20 mg/L组（4）强力霉素40 mg/L组（5）F Notch1 0.407 2±0.003 0 0.514 5±0.002 6a0.625 3±0.002 5ab0.682 6±0.003 6abc0.736 8±0.002 3abcd6 661.907＊＊MMP-9 0.937 8±0.003 1 0.825 6±0.002 7a0.633 4±0.003 2ab0.518 3±0.003 3abc0.434 6±0.003 4abcd13 419.911＊＊

3 讨论

3.1 强力霉素的作用机制 近年来，强力霉素的非抗菌作用得到了较多研究，已应用于肿瘤[1-2]、骨关节炎[4]和动脉粥样硬化治疗[5]等多方面。强力霉素是MMPs的有效抑制剂。MMPs是一种锌离子依赖性内肽酶，其中，MMP-9是MMPs中分子质量最大的酶，可降解基底膜，为血管内皮细胞的迁移和新生血管的延伸创造了必要条件，进而导致肿瘤的生长和扩散[6]。目前，强力霉素抑制MMPs的机制并不是十分清楚，有研究认为可能与强力霉素的Ca2+、Zn2+结合能力有关，其通过形成螯合物消除了MMPs的催化活化位点，从而抑制MMPs[7]。

Figure 2 Effect of different concentrations of doxycycline on Notch1 and MMP-9 expression图2 不同浓度强力霉素对Notch1和MMP-9表达的影响

3.2 Notch1信号通路的可能作用机制 Notch信号通路的错误调节可引起人体较大范围的障碍，包括发育综合征、癌症[8]等。该信号通路有4种受体（Notch1～4）和5种配体（Jagged1、Jagged2、Deltalike1、Delta-like3、Delta-like4），其中Notch1与Jagged1为最重要的受体和配体。Notch1的胞外域与Jagged1结合后可促进Notch1胞内活性域NICD释放，NICD进入核内后诱导靶基因的转录。赵娜等[9]研究发现，Notch1低表达可能诱导核因子（NF）-κB高表达，进而导致胃癌的发生。并且通过对MMPs基因结构分析发现，在MMPs基因启动子近端调控区有特异性的NF-κB结合位点，去除NF-κB结合位点后可使MMPs表达降低[10]。

3.3 强力霉素通过Notch信号通路抑制胃癌细胞增殖可能性机制 本实验发现强力霉素对胃癌细胞的生长具有明显的抑制作用，并且具有时间、浓度依赖性，这与谢兆兰等[11]的报道一致；不同浓度强力霉素作用胃癌细胞48 h后，随着浓度的增加，强力霉素可以上调Notch1蛋白的表达，抑制MMPs的表达，因此推测强力霉素可能通过促进Notch信号通路来抑制NF-κB的表达，从而进一步抑制MMPs的表达来发挥抗癌作用。

本研究似可为胃癌治疗提供新的可能方法，然而将四环素类MMPs抑制剂应用于胃癌的临床治疗仍旧有很长的路需要探索。

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（2013-11-08收稿 2014-02-14修回）

（本文编辑 李鹏）

Effect of Doxycycline on Gastric Cancer Cell Proliferation and Notch1,MMP-9 Expression

XU Min，LI Hong
Department of Biochemistry,Liaoning Medical College,Jinzhou,Liaoning 121000,China

ObjectiveTo investigate the effect of Doxycycline on gastric cancer cell line BGC-823 proliferation and Notch1,Matrix metalloproteinase-9（MMP-9）expression in order to shine a light on new anticancer drugs.MethodsFinal concentration of 0,5,10,20,40 mg/L doxycycline were added into human gastric cancer cell line BGC-823.Cell proliferation was detected by MTT;Cell cycle distribution was assessed by flow cytometry;Notch1,MMP-9 protein expression was revealed by Immunoblot.ResultsDoxycycline can inhibit proliferation of human gastric cancer cells line BGC-823, and its effect is dose and time-dependent（P＜0.01）.Doxycycline alters distribution of gastric cancer cell line BGC-823. With increasing drug concentration,the proportion of cells in S phase dropped（P＜0.01）.Notch1 expression rose and MMP-9 expression decreased（P＜0.01）.ConclusionDoxycyclinecan inhibited gastric cancer cell line BGC-823 proliferation and up-regulating Notch1 might be one mechanisms.

stomach neoplasms；cell line,tumor；receptor,Notch1；matrix metalloproteinase 9；cell proliferation；cell cycle；DOXYCYCLINE

R735.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.006

*辽宁省自然科学基金资助项目（项目编号：201102125）

辽宁锦州，辽宁医学院生物化学教研室（邮编121001）

△通讯作者 E-mail：jzmu-lihong@sina.com