自噬相关蛋白在肺鳞癌和腺癌组织中的表达及相关性研究*

郭 凯 黄 波 王晓东

自噬相关蛋白在肺鳞癌和腺癌组织中的表达及相关性研究*

郭 凯 黄 波 王晓东△

目的 探讨肺鳞癌和腺癌中自噬相关蛋白Beclin1、自噬相关蛋白1（Atg1）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表达情况及其相关性分析。方法采用免疫组织化学Envision二步法，检测82例肺癌（鳞癌和腺癌）组织及17例癌旁正常肺组织中Beclin1、Atg1、mTOR的表达情况，并分析其表达的相关性。结果肺癌组织中Beclin1的阳性表达率低于正常组（52.44%vs 94.12%，P＜0.01），在淋巴结转移、TNM分期、不同分化程度情况的肺癌组织中阳性表达率差异有统计学意义，且随肿瘤恶变和侵袭程度的增强呈递减趋势。肺癌组与正常组Atg1阳性表达率比较差异无统计学意义（64.71%vs 46.34%），但在肿块较大肺癌组织中的阳性表达率低于肿块较小者（P＜0.01）。肺癌组mTOR阳性表达率高于正常组（53.66%vs 5.88%，P＜0.01），有淋巴结转移的肺癌组织中mTOR阳性表达率高于无淋巴结转移者（P＜0.01）。相关性分析显示，鳞癌中Beclin1与Atg1表达呈正相关（r=0.609），Beclin1、Atg1分别与mTOR呈负相关（r分别为-0.617、-0.444）；肺腺癌中，Beclin1与Atg1表达呈正相关（r=0.458），Beclin1、Atg1分别与mTOR呈负相关（r分别为-0.497，-0.541），均P＜0.01。结论Beclin1、Atg1、mTOR在肺鳞癌和腺癌组织中的表达呈现较好的相关性，提示肺鳞癌和腺癌的临床病理学变化与自噬有关。

肺肿瘤；癌,鳞状细胞；腺癌；自噬；Beclin1；自噬相关蛋白1；雷帕霉素靶蛋白

肺鳞癌起源于支气管上皮，约占原发性肺癌的40%～50%，腺癌主要起源于较小的支气管黏膜中分泌黏液的上皮细胞，女性多见，约占肺癌发病率的20%～30%。近年来研究表明，自噬是细胞内物质代谢的重要途径之一，而其调控机制的失活与肿瘤的发生发展密切相关[1-2]。Beclin1、自噬相关蛋白1（autophagy-related protein 1，Atg1）、雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin,mTOR)是编码自噬相关蛋白的重要基因[3-4]。本研究通过检测Beclin1、Atg1、mTOR在不同分化程度肺鳞癌和肺腺癌中的表达情况，探讨其对肺癌发生发展的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2012年4月—2013年4月有完整临床及病理资料的肺鳞癌和肺腺癌患者82例，其中男46例，女36例，年龄32～73岁，平均（53.00±10.43）岁。所有病例均经病理证实，术前未经过放化治疗。按照国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control,UICC）2009年修订的pTNM分期标准：Ⅰ期26例，Ⅱ～Ⅲ期56例。按照WHO肺癌分类标准：鳞癌（SCC）39例，腺癌43例；中、高分化56例，低分化26例。瘤体直径≥3 cm者47例，＜3 cm者35例；有淋巴结转移38例，无淋巴结转移44例。另收集同一患者的距癌组织＞5 cm、经HE染色证实无癌细胞浸润的正常余肺组织17例（正常组）。所有标本的使用均经我院伦理委员会同意，取得患者或家属的知情。

1.2 主要试剂及仪器 鼠抗人Beclin1、mTOR单克隆抗体、兔抗人Atg1单克隆抗体均购自美国abcam生物公司。PV9000辣根酶标记羊抗兔/小鼠二抗试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡切片机、摊片烤片机（德国莱卡公司）。

1.3 方法 手术切除后的标本迅速经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，厚度5 μm切片。采用免疫组化Envision法二步法进行检测，具体步骤如下：切片常规脱蜡至水，将切片置于含pH 6.0枸椽酸缓冲液的高压锅内，加热至减压阀喷气2 min以修复抗原，自然冷却后，PBS洗涤；3%过氧化氢溶液处理10～30 min以去除内源性过氧化物酶；滴加适当浓度稀释的一抗（鼠抗人Beclin1抗体），4℃孵育过夜；滴加聚合物辅助剂，37℃孵育30 min；滴加辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体（PV9000）37℃孵育30 min,以上各步骤间均采用0.01 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min；DAB显色；苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。阴性对照用PBS替代一抗。Atg1、mTOR蛋白染色步骤同上。

采用Greenspan半定量法对阳性细胞比例及染色强度进行评分。阳性细胞比例及染色强度均分为1、2、3、4等4个级别，对应的阳性细胞数量分别为≤10%、11%～25%、26%～50%、≥51%，对应的染色强度分别为无着色、淡棕黄色、棕黄色、深棕色。阳性细胞比例与染色强度评分相乘，≤2分者为阴性,＞2分者为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计数资料组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Bivariate（Spearman）等级相关性分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 肺癌组、正常组各蛋白阳性表达情况 Beclin1蛋白定位于细胞膜和细胞质，Atg1蛋白定位于细胞质，mTOR蛋白表达于阳性细胞的细胞质内，呈棕黄色颗粒。肺癌组Beclin1阳性表达率低于正常组，mTOR阳性表达率高于正常组（P＜0.01），2组间Atg1阳性表达率差异无统计学意义，见表1，图1、2。

Table 1 Comparison of Beclin1,Atg1 and mTOR expression between normal tissue and lung cancer表1 Beclin1、Atg1、mTOR的阳性表达情况例（%）

2.2 不同临床病理特征肺癌患者组织中各蛋白阳性表达情况比较 不同淋巴结转移、TNM分期、分化程度情况的肺癌组织中Beclin1阳性表达率差异有统计学意义，随肿瘤恶变和侵袭程度的增强呈递减趋势；肿块较大肺癌组织中Atg 1阳性表达率较低（P＜0.01）；有淋巴结转移的肺癌组织中mTOR阳性表达率高于无淋巴结转移者（P＜0.01）；其余不同临床病理特征肺癌患者组织间相应蛋白阳性表达率比较差异均无统计学意义，见表2，图1、2。

2.3 自噬相关蛋白表达的相关性 相关性分析结果显示，肺鳞癌组织中，Beclin1与Atg1表达呈正相关，Beclin1、Atg1分别与mTOR呈负相关；肺腺癌组织中，Beclin1与Atg1表达呈正相关，Beclin1、Atg1分别与mTOR呈负相关，见表3。

3 讨论

自噬是指细胞质内的细胞器和大分子物质在膜包囊泡中的降解过程[5]。在生理状态下，自噬具有维持细胞稳态和促进细胞生存的作用，但是过度的自噬可引起细胞死亡。目前关于肿瘤细胞自噬的研究报道不一，有研究表明肿瘤细胞的自噬活性降低，也有研究显示某些肿瘤细胞保持了较高的自噬活性，如胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌等[6-7]。

自噬主要受mTOR复合体和Beclin1复合体的调节，mTOR通路的激活抑制自噬的发生，而Be-clin1复合体可促进自噬的发生。Atg1蛋白是启动自噬通路的一个关键的丝氨酸苏氨酸激酶，Atg1与Atg13、Atg17蛋白形成复合体后能够高效的激活自噬。而mTOR复合体（TORC1）是调控Atg1复合体活性的最主要上游分子[8]，TORC1作为雷帕霉素的靶分子，具有丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的活性。TOR信号通路是调控细胞生长、增殖、自噬的重要信号通路，该通路可以整合来自糖、氨基酸、生长因子等多种信号，调控胞内蛋白的合成和降解。mTOR通过与Atg1结合形成复合体，抑制Atg1的激酶活性，进一步抑制自噬的发生[9]。而Beclin1基因杂合缺失是细胞发生恶变转化的原因之一，研究发现Beclin1可与PI3K形成复合体来调节Atg蛋白在自噬前体结构中的定位，发挥调节自噬的作用[10]。Beclin1基因缺失大鼠中的自噬形成有缺陷，而且恶性肿瘤的发生率明显提高，所以Beclin1被认为是一种肿瘤抑制基因[11]。研究发现MCF7乳腺癌细胞中稳定超表达Beclin1可降低细胞增殖和成瘤能力[12]。

Table 2 Beclin1,Atg1 and mTOR expression in lung cancer表2 Beclin1、Atg1、mTOR在肺鳞癌和腺癌中的表达情况 例（%）

Table 3 Correlation of Beclin1,Atg1 and mTOR in lung cancer表3 Beclin1、Atg1、mTOR在肺鳞癌和腺癌中的相关性 （例）

本研究结果显示，癌旁正常肺组织中Beclin1呈高表达，mTOR表达较少，而在肺鳞癌和腺癌中则呈相反的表达趋势，并且Beclin1在不同淋巴结转移、TNM分期、分化程度情况的肺癌组织的阳性表达率有明显差异，肿块较大肺癌组织中Atg 1阳性表达率较低，有淋巴结转移的肺癌组织中mTOR阳性表达率高于无淋巴结转移者。Beclin1与Atg1呈明显的正相关，而二者与mTOR呈现明显的负相关。在正常情况下，机体通过细胞自噬清除衰老的细胞器，维持机体的自我更新。在肿瘤发生的早期，自噬蛋白Beclin1、Atg1表达量较正常时降低，但仍发挥一定的自噬的作用，以抑制肿瘤细胞的形成[13]。当肿瘤细胞增殖活跃时，可能引起mTOR和PI3K的活性改变，mTOR通过与Atg1结合形成复合体，抑制Atg1的激酶活性，抑制Atg1复合体的形成，进一步抑制自噬的发生。而PI3K活性的改变，影响了Beclin1复合体的形成，从而影响自噬的发生。由于肿瘤细胞凋亡不足、自噬功能下降，导致本应该通过凋亡或自噬性死亡的细胞不能发生凋亡或自噬性死亡，引起细胞的异常增多，最终导致癌变。本研究可对肺癌患者的诊断、预后判断提供实验支持，并且为进一步采用蛋白抑制剂靶向干预自噬以防止肺癌的侵袭和转移提供理论依据，具有一定的临床应用价值。

Figure 1 Beclin1,Atg1 and mTOR expression in lung SCC(Envision,×400)图1 Beclin1、Atg1、mTOR在不同分化程度肺鳞癌中的表达（Envision法，×400）

Figure 2 Beclin1,Atg1 and mTOR expression in lung adenocarcinoma(Envision,×400)图2 Beclin1、Atg1、mTOR在不同分化程度腺癌中的表达（Envision，×400）

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（2013-10-09收稿 2014-02-07修回）

（本文编辑 李国琪）

Expression and Correlated Analysis of Autophagy-related Proteins in Human Squamous Cell Carcinoma and Adenocarcinoma of Lung

GUO Kai,HUANG Bo,WANG Xiaodong
The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121000,China

ObjectiveTo explore expression of Beclin1,autophagy-related protein 1(Atg1),mammalian target of rapamycin(mTOR)in squamous cell carcinoma(SCC)and adenocarcinoma of lung and to analyse relationship among these three factors.MethodsImmunohistochemical stainning was applied to detect expression of Beclin1,Atg1 and mTOR in 82 samples of SCC and adenocarcinoma of lung(lung cancer group)and 17 samples of paraneoplastic normal lung tissues(control group).Correlations of expression of Beclin1,Atg1 and mTOR were analyzed in SCC and adenocarcinoma of lung.Re⁃sultsThe expression of Beclin1 was significantly lower in lung cancer group than that in control group（52.44%vs 94.12%，P＜0.01）.There were significant differences of the differentiation,TNM stages and lymph node metastasis in lung cancer group compared with those in control group.And Beclin1 expression showed a decreasing trend with malignant and invasive of tumors.mTOR expression in lung cancer tissue with lymph nod metastasis is higher than that in the tissue without lymph node metastasis（P＜0.01）.Atg1 expression in lung cancer tissue with larger mass is less than that in lung cancer tissue with small lumps（P＜0.01）.Beclin1 Expression was positively correlated with the Atg1 expression in SCC（r=0.609，P＜0.01）. Beclin1 and Atg1 expressions were both negatively correlated with mTOR expression in SCC（r=-0.617，-0.444，P＜0.01）. Beclin1 expression was positively correlated with Atg1 expression in adenocarcinoma（r=0.458，P＜0.01）.Beclin1 and Atg1 expression were both negatively correlated with mTOR expression in adenocarcinoma（r=-0.497，-0.541，P＜0.01）.Conclu⁃sionBeclin1,Atg1 and mTOR expression showed a strong correlation in lung cancer,and clinicopathological change of lung SCC and adenocarcinoma may be related to autophagy.

lung neoplasms;carcinoma,squamous cell;adenocarcinoma;autophagy;Beclin1;autophagy-related protein 1;target of rapamycin

R734.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.007

*辽宁省科技厅基金资助项目（项目编号：201202143）

辽宁医学院附属第一医院胸外科（邮编121000）

△通讯作者 E-mail:antiy3018@sina.com