聚乙二醇对7-乙基-10-羟基喜树碱体外稳定性及对小鼠淋巴摄取的影响

银晓晶，廖 栩，张 瑜，何 蕊，王淑君*

(1. 沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016；2. 沈阳鑫泰格尔医药科技开发有限公司，辽宁 沈阳 110034；3. 沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016)

聚乙二醇对7-乙基-10-羟基喜树碱体外稳定性及对小鼠淋巴摄取的影响

银晓晶1，廖 栩2，张 瑜1，何 蕊3，王淑君3*

(1. 沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016；2. 沈阳鑫泰格尔医药科技开发有限公司，辽宁 沈阳 110034；3. 沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016)

目的本文研究不同相对分子质量的聚乙二醇（PEG）溶解7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin, SN-38)对其体外稳定性以及小鼠淋巴摄取量的影响。方法 体外实验在SN-38的pH值7.4的PBS饱和溶液中分别加入乙醇、PEG200、PEG400、PEG800，37 ℃水浴12 h，用HPLC测定SN-38含量；在体内实验中分别将SN-38用乙醇及含体积分数50%PEG200-800的乙醇溶液配制成质量浓度为1 g·L-1的SN-38溶液剂，将上述SN-38的溶液剂在小鼠右后脚掌皮下注射，剂量为1 mg·kg-1。给药后分别于不同时间点用HPLC测定小鼠淋巴结及脚掌中的SN-38的含量。结果 体外的稳定性实验测得SN-38含量为PEG200组＞PEG400组＞PEG800组＞乙醇组；乙醇组与PEG200-800组小鼠淋巴结中药物的含量结果与体外稳定性结果一致。结论 PEG能够稳定SN-38的内酯环从而增强SN-38的淋巴摄取量，并且随着PEG相对分子质量的增加，这种稳定作用减弱。

药剂学；7-乙基-10-羟基喜树碱；聚乙二醇；皮下给药；内酯环稳定性；淋巴摄取

7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin, SN-38)是伊立替康(iritecan, CPT-11)的活性代谢产物，是喜树碱经化学结构修饰而制得的衍生物。SN-38具有抗癌作用强、抗癌活性高，其活性几乎是CPT-11的100～1 000倍[1-2]，但是SN-38的溶解性差、内酯环不稳定及严重的毒性限制了其临床应用[3]。SN-38的α-内酯环是其抗癌活性的关键部位，内酯环开环会导致喜树碱及其衍生物完全失去活性[4]。SN-38在酸性和碱性条件下存在形式不同，在酸性条件下是内酯环形式（SN-38A）即活性形式，而碱性条件下是羧酸盐形式（SN-38I）[5-6]。在实验中为了增加SN-38的溶解度加入了PEG，作者发现PEG的加入不仅增加了SN-38溶解度而且对SN-38的内酯环也有稳定作用，与此同时，对小鼠淋巴摄取量也有很大的改善。因此，作者用不同相对分子质量的PEG溶解SN-38考察其在体外对SN-38内酯环的稳定作用，及其对小鼠淋巴摄取量的影响。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪（紫外SPD-10A 检测器、LC-15C液相泵，日本Shimadzu 公司），RE52CS真空旋转蒸发仪（上海生化亚荣仪器厂），SHB-3循环水式多用真空泵（郑州杜甫仪器厂），SCQ2201超声波清洗器（上海声彦超声波仪器有限公司），JY92-2D超声波细胞粉碎机（宁波新芝仪器研究所），pH计（上海宇隆仪器有限公司），TGL-18C快速离心机（上海安亭科学仪器厂），HC-2062高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），SK-1快速混匀器（江苏金坛荣华仪器制造有限公司），MD200 氮气吹扫仪（杭州奥盛仪器有限公司）。

肝素钠注射液（天津生化制药厂），7-乙基-10-羟基喜树碱（荆门帅邦化学科技有限公司），喜树碱（四川南部诚信科技有限公司），磷酸二氢钠、磷酸（天津博迪化工有限公司），PEG200（天津瑞金特化学品有限公司），PEG400（天津博迪化工股份有限公司），PEG800（天津光复精细化工研究所），无水乙醇（分析纯，天津富宇精细化工有限公司），乙腈、甲醇（色谱纯，天津康科德公司），其他试剂（分析纯，市售）。

昆明种小鼠6～8周龄，(20±2) g，雄性，由沈阳药科大学动物试验中心提供，合格证号211002300000821，许可证号SCKK（辽）2010-0001。

2 方法与结果

2.1 SN-38A 和SN-38I 体外含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：德国CenturySIL BDS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：25 ℃，流动相：NaH2PO4与Na2HPO4缓冲盐溶液(25 mmol·L-1，pH = 3.1)-乙腈(体积比70︰30)，流速：1.4 mL•min-1，紫外检测波长：381 nm，进样量：20 μL。

2.1.2 专属性实验

分别取SN-38I、SN-38A和二者混合溶液，各取20 μL注入液相色谱仪，按“2.1.1”条色谱条件分析测定，色谱图见图1。由图1可知，二者在该液相条件下能够很好的分离。

图1 液相色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram

2.1.3 标准曲线的制备

SN-38A标准曲线：精密称取SN-38适量，用乙腈溶解并定量稀释成质量浓度为100 mg•L-1的SN-38贮备液。精密量取SN-38贮备液适量，用含体积分数0.5%乙酸的乙腈溶液稀释配成SN-38A不同质量浓度的标准溶液。分别吸取各标准溶液20 μL，按“2.1.1”条色谱条件测定。以峰面积(A)对质量浓度(ρ, mg·L-1) 进行线性回归，求得SN-38A 的标准曲线方程为A=5.759 8×104ρ+8.423 7×104，r=0.999 8，SN-38 A质量浓度在0.1～10 mg·L-1内与峰面积呈良好的线性关系。

SN-38I标准曲线：精密称取SN-38适量，用乙腈溶解并定量稀释成质量浓度为100 mg•L-1的SN-38贮备液。精密量取SN-38贮备液适量，用pH值10.0的PBS溶液稀释配成SN-38I不同质量浓度的标准溶液。分别吸取各标准溶液20 μL，按“2..1.1”条色谱条件测定。以峰面积(A)对质量浓度 (ρ，mg·L-1) 进行线性回归，求得SN-38I 的标准曲线方程为A=4.604 2×104ρ+17.88，r=0.999 9，SN-38 I质量浓度在0.1～10 mg·L-1内与峰面积呈良好的线性关系。

经方法学验证，该方法精密度、准确度良好，符合方法学要求。

2.2 SN-38在不同相对分子质量PEG中的体外稳定性实验

2.2.1 溶液的配制

称取过量的SN-38置于量瓶中，加入pH值7.4的PBS，超声，0.45 μm的滤膜过滤得到SN-38的饱和溶液。取5 mL SN-38饱和溶液4份置于4个10 mL量瓶中，分别用乙醇、PEG200、PEG400、PEG800稀释至刻度，得到SN-38在不同相对分子质量PEG中的溶液。

2.2.2 样品含量测定

将“2.2.1”条配制的SN-38在不同相对分子质量PEG的溶液置于37 ℃水浴中，30 r·min-1磁力搅拌12 h，取出样品，HPLC进样分析，测定SN-38A和SN-38I的峰面积，代入标曲计算质量浓度。SN-38A所占比例为闭环质量浓度比开环与闭环总的质量浓度。所得结果见表1。

表 1 SN-38A在不同PEG溶液中的百分比Table 1 The proportion of SN-38A in different PEG solutions

由结果可知，SN-38A在不同相对分子质量PEG中所占比例为PEG200＞PEG400＞PEG800＞乙醇。

2.3 SN-38体内HPLC分析方法的建立

2.3.1 色谱条件

方法同“2.1.1”条。

2.3.2 溶液的配制

SN-38A标准溶液的配制：精密称取SN-38适量，用乙腈溶解并定量稀释成质量浓度为100 mg•L-1的SN-38贮备液，于4 ℃冰箱保存。精密量取SN-38贮备液适量，用含体积分数0.5%乙酸的乙腈溶液稀释成质量浓度分别为25、50、100、1 000、2 500、5 000 mg•L-1的系列标准溶液。

内标液的配制：精密称取喜树碱适量，加入含体积分数0.5%乙酸的乙腈溶液溶解并稀释至5 000 mg•L-1的溶液，作为内标液，于4 ℃冰箱保存。

2.3.3 血浆样品的处理方法

精密吸取小鼠血浆样品50 µL置于1.5 mL离心试管中，加入喜树碱内标液50 µL，涡旋30 s，加入含体积分数0.5%乙酸的乙腈溶液150 μL，旋涡1 min，于16 000 r·min-1离心10 min。小心吸取上清液至另一干净的1.5 mL的EP管中，50 ℃氮气流下吹干，干燥后样品加入50 µL流动相复溶，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液20 μL进样，进行HPLC分析，测定SN-38(A)的含量。

2.3.4 淋巴结样品的处理方法

取小鼠淋巴结，按每个淋巴结加入100 μL生理盐水匀浆。精密移取淋巴结匀浆样品50 µL，置于1.5 mL离心试管中，加入喜树碱内标液50 µL，涡旋30 s，加入含体积分数0.5%乙酸的乙腈溶液150 μL，旋涡1 min，于16 000 r·min-1离心10 min。小心吸取上清液至另一干净的1.5 mL的EP管中，50 ℃氮气流下吹干，干燥后样品加入50 µL流动相复溶，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液20 μL进样，进行HPLC分析，测定小鼠淋巴结中SN-38(A)的含量。

2.3.5 脚掌样品的处理方法

取小鼠脚掌，称质量，按脚掌质量的5倍量加入生理盐水匀浆。精密移取脚掌匀浆样品50 µL，置于1.5 mL离心试管中，加入喜树碱内标液50 µL，涡旋30 s，加入含体积分数0.5%乙酸的乙腈溶液150 μL，旋涡1 min，于16 000 r·min-1离心10 min。小心吸取上清液至另一干净的1.5 mL的EP管中，50 ℃氮气流下吹干，干燥后样品加入50 µL流动相复溶，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液20 μL进样，进行HPLC分析，测定小鼠脚掌中残留的SN-38(A)的含量。

2.3.6 方法专属性试验

取小鼠空白血浆、空白淋巴结和空白脚掌，除不加内标溶液外，其余按“2.3.3～2.3.5”条方法处理并分析，获得空白样品的色谱图；将一定质量浓度的SN-38标准溶液和内标溶液加入小鼠空白血浆及组织中，同法操作，获得相应的色谱图；同法得到小鼠给药后血浆、淋巴结及脚掌样品色谱图（图2）。结果表明，组织中内源性物质不干扰SN-38的测定。

图2 SN-38在小鼠血浆、淋巴结及脚掌中的液相色谱图Fig. 2 HPLC chromatograms of SN-38 in mice plasma, lymph nodes and limb soles

2.3.7 标准曲线的绘制

取干净的1.5 mL EP管，精密吸取SN-38系列标准溶液，37 ℃氮气流下吹干，分别加入小鼠空白血浆、空白淋巴结匀浆液和空白脚掌匀浆液各50 µL，配置成相当于SN-38质量浓度为25、50、100、1 000、2 500和5 000 μg·L-1的标准样品，按“血浆及组织样品处理方法”项下操作，进样20 µL，记录色谱图。以SN-38的质量浓度为横坐标，以药物样品峰面积与内标物样品峰面积之比（AS/AI）为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得线性回归方程。SN-38在小鼠血浆、淋巴结、脚掌中的标准曲线方程见表2。

表 2 SN-38(A)在血浆、淋巴结及脚掌的液相方法标准曲线Table 2 Calibration curves of SN-38(A) for plasma, lymph nodes and limb soles by HPLC method

2.3.8 提取回收率

用空白生物样品按“2.3.7”条方法配制含SN-38低、中、高3个质量浓度（分别为25、100、5 000 μg·L-1）的质量控制（QC）样本，每一个质量浓度各5样本，以处理后SN-38的峰面积除以未经提取相应质量浓度的SN-38的峰面积，即为SN-38的提取回收率。内标提取回收率方法同上，SN-38提取回收率结果见表3。

由试验结果可知，SN-38与内标的提取回收率均大于50%，且提取回收率比较稳定，说明该方法适合SN-38的体内提取。

2.3.9 精密度与准确度

取小鼠空白血浆、空白淋巴结匀浆液和空白脚掌匀浆液各50 µL，按“2.3.7” 条方法配制含SN-38低、中、高3个质量浓度的质量控制（QC）样本，每一质量浓度5样本，各3批，连续测定3 d，与标准曲线同时进行。计算QC样品的日间和日内相对标准偏差，结果见表4。

2.3.10 SN-38在血浆中稳定性的研究

考察了血浆样品室温放置8 h、血浆样品经历3次冻融循环、血浆样品−20 ℃放置7 d、血浆样品经处理后4 ℃放置12 h的稳定性。精密吸取小鼠血浆50 µL，按“2.3.7”条方法制备SN-38低、中、高3个质量浓度（分别为25、100、5 000 μg·L-1）的质量控制（QC）样品，每一质量浓度5样本分析，按照“2.3.3”条方法操作，测得样品质量浓度。SN-38在小鼠空白血浆中的稳定性结果见表5。

表4 SN-38(A)测定的精密度与准确度Table 4 Precision and accuracy of method for determination of SN-38(A)

表5 SN-38(A)在小鼠血浆中不同贮存条件下的稳定性(n=5)Table 5 Stability of SN-38(A) at different storage conditions in mice plasma (n=5)

结果表明，SN-38在以上条件下均可稳定存在，而在实际试验的过程中血浆样品取出后均被立即放入冰箱中贮存、待处理及分析。

2.4 不同相对分子质量PEG溶解SN-38对其淋巴摄取量实验

2.4.1 溶液配制

精密称取SN-38原料药10 mg共 4份置于4个10 mL量瓶中，分别加入乙醇、PEG200、PEG400和PEG800 5 mL后加适量乙醇溶解，用乙醇稀释至刻度，得到质量浓度为1 g·L-1的SN-38溶液剂。

2.4.2 小鼠给药方案及样品采集

取昆明种小鼠72只，分成4组，分别为乙醇组、PEG200组、PEG400组、PEG800组，每组18只，小鼠给药前自由饮食饮水，从小鼠的右后脚垫皮下分别注射“2.1”条配制的SN-38溶液剂20 μL，使每组每个时间点都有3只小鼠。给药后于30 min、1 h、2 h、4 h、8 h和12 h眼眶取血于肝素抗凝管中，8 000 r·min-1离心10 min分离血浆。立即置冰箱（-20 ℃）保存待测。将取血后的小鼠断颈处死，迅速取出小鼠右腘淋巴结和右后脚掌，用生理盐水冲洗表面血液及内容物后，装入自封袋，于-20 ℃保存至分析测定。

2.4.3 试验结果与数据处理

2.4.3 .1 血浆中的药物浓度测定

按照“2.3.3”条方法处理血浆样品，取上清液20 μL进样，进行HPLC分析，将所得峰面积带入血浆标曲计算血浆中SN-38(A)的质量浓度，测定给药后不同时间点小鼠血浆中SN-38(A)的含量，结果见图3。

图3 皮下注射1 mg·kg-1SN-38血浆中SN-38(A)的质量浓度Fig. 3 SN-38(A) concentration in plasma after subcutaneous administration at the dose of 1 mg·kg-1. The data arepresented as threemean value ± S.D.

采用统计矩模型进行数据的处理，结果见表6。

表 6 皮下给药剂量1 mg·kg-1 SN-38(A)在血浆中的药动学参数Table 6 Pharmacokinetic parameters of SN-38(A) in plasma after subcutaneous administration at the dose of1 mg·kg-1

由图3和表6可知，皮下注射后会有少量药物入血，其中乙醇组和PEG800组中SN-38的量显著高于其他组，血浆中SN-38在PEG800中的达峰时间显著长于其他组，分析可能的原因是由于PEG800相对分子质量大，其黏度大，延缓了药物进入血液循环的时间。

2.4.3 .2 腘淋巴结中SN-38含量的测定

按照“2.3.4”条方法处理淋巴结，取上清液20 μL进样，进行HPLC分析，将所得峰面积带入标准曲线计算SN-38(A)在淋巴结内的质量浓度，测定给药后不同时间点小鼠腘淋巴结匀浆液中的SN-38(A)的含量，结果见图4。

图 4 皮下给药剂量1 mg·kg-1 SN-38(A)在前哨淋巴结中的浓度Fig. 4 SN-38(A) concentration in popliteal lymph nodes after subcutaneous administration at the dose of 1 mg·kg-1.The data are presented as the mean value ± S.D.

采用统计矩模型进行数据的处理，结果见表7。

表 7 皮下给药剂量1 mg·kg-1SN-38(A)在前哨淋巴结中的药动学参数Table 7 Pharmacokinetic parameters of SN-38(A) in popliteal lymph nodes after subcutaneous administration at thedose of 1 mg·kg-1

由图4和表 7可知，PEG组的药时曲线下面积均高于乙醇组，PEG组SN-38在淋巴结中的分布均好于乙醇组，药时曲线下面积大小顺序为PEG200＞PEG400＞PEG800＞乙醇，随着PEG相对分子质量增大，AUC减小；由表7可知，相比于乙醇组，PEG组显著延长了SN-38的随着PEG相对分子质量增大，SN-38在淋巴结中的减小，但均长于乙醇组。由此可以得知，PEG不仅增加了SN-38的淋巴摄取量，还延长了SN-38在小鼠淋巴结中的生物半衰期，并且这种延长作用随着PEG的相对分子质量增大而减弱。

2.4.3 .3 注射部位的药物残留

注射部位残留结果见图5，由结果可知，乙醇组的药物残留量最多，显著高于PEG组，药物残留量大小顺序为乙醇＞PEG400＞PEG200＞ PEG800。

图 5 皮下给药剂量1 mg·kg-1注射部位残留的SN-38(A)的含量Fig. 5 SN-38(A) remaining at the injection site after subcutaneous administration at the dose of 1 mg·kg-1. The dataare presented as mean values ± S.D.

3 讨论

a．SN-38在不同相对分子质量PEG中的体外稳定性实验中，虽然用不同相对分子质量的PEG定容到同一刻度，但是由于PEG的相对分子质量不同，其黏度不同，磁力搅拌后，液面会有所变化，导致最终测得的SN-38A和SN-38I的总和不同，因此，采用SN-38A的质量浓度比SN-38A和SN-38I质量浓度的加和计算SN-38A所占比例。

b．淋巴结、脚掌及血浆中SN-38的测定只测定SN-38(A)是因为体内样品的内源性物质会干扰SN-38（I）的测定，使测定结果不准确，因此，只比较SN-38(A)在淋巴结、血浆及脚掌中的含量。

c．淋巴结中SN-38(A)的AUC大小为PEG200＞PEG400＞PEG800＞乙醇，但是脚掌中PEG200和PEG400组的SN-38(A)的滞留量比PEG800多的原因可能是因为PEG800组的药物进入血液循环的量较多，而PEG200与PEG400组中的药物进入血液循环的量较少，故脚掌残留量PEG800组比PEG200和PEG400组少。

d．血浆中SN-38(A)的含量测定结果，PEG800组在12 h时SN-38达到峰浓度，而其他3组都是在2 h时达到峰浓度的原因是PEG800的相对分子质量较大，其黏度也较大，因此，其进入血液循环的达峰时间也相对较晚，延缓了SN-38进入血液循环的时间。

[1] JONES J M．Physician desk reference[M]. 57th ed．Montvale, NJ : Thomson PDR . Medical Economics ,2003: 218．

[2] TAKIMOTO C H，ARUCK S G. Cancer chemotherapyand biotherapy: principles and practice[M]. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2001: 579-646．

[3] MATHIJSSEN, RON H J, VAN ALPHEN, et al. Clinical Pharmacokinetics and Metabolism of Irinotecan (CPT-11) [J]. Clinical Cancer Research, 2001, 7: 2182–2194.

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In vitro stability and the effects of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin dissolving in poly(ethylene glycol) on lymphatic uptake in mice

YIN Xiao-jing1, LIAO Xu2, ZHANG Yu1, HE Rui3, WANG Shu-jun3*
(1. School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2. Shenyang Newtiger Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shenyang 110034, China; 3. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

ObjectiveTo study the effect of different molecular weight poly(ethylene glycol) (PEG) on in vitro stability of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin(SN-38) and lymphatic uptake in mice after subcutaneous administration. Methods To investigate the stability in vitro, after addition of ethanol, PEG200, PEG400, PEG800 to saturated solution of SN-38 in pH 7.4 PBS individually, the solutions were maintained at 37 ℃in waterbath for 12 h, then the concentration of SN-38 was determined with HPLC；for the in vivo study, SN-38 was dissolved in ethanol and ethanol solution containing 50% PEG200-800 with the concentration of 1 g·L-1, respectively. The above SN-38 solutions were administrated into the right soles of mice subcutaneously at the dose of 1 mg·kg-1. Then, the concentrations of SN-38 at different time points were detected with HPLC. Results The stability study show that the concentrations of SN-38 in different PEG solutions were in the order of PEG200＞PEG400＞PEG800＞ethanol, and the concentrations of SN-38 in the popliteal lymph nodes of mice for different solutions were in accordance with the result in vitro. Conclusion PEG can stabilize the lactone ring of SN-38 and enhance the lymphatic uptake of SN-38.

pharmaceutics; 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin; poly(ethylene glycol); subcutaneously administration；stability of the lactone ring; lymphatic uptake

R 94

A

（2014）02–0062–11

(本篇责任编辑：马丽丽)

2014–01–02

银晓晶(1988-)，女(汉族)，辽宁沈阳人，硕士研究生，E-mail 245560433@qq.com；*通讯作者：王淑君(1972-)，女(汉族)，浙江舟山人，教授，博士，主要从事药物制剂研究，Tel. 024–23986360，E-mail 1252116911@qq.com。