壮医针挑对哮喘小鼠miRNA-126、IL-4、IFN-g及IgE的影响

唐汉庆,窦锡彬,李克明,郑建宇,李晓华,朱晓莹



壮医针挑对哮喘小鼠miRNA-126、IL-4、IFN-g及IgE的影响

唐汉庆1,窦锡彬1,李克明1,郑建宇2,李晓华1,朱晓莹1

(1.右江民族医学院,百色 533000;2.右江民族医学院附属医院,百色 533000)

观察壮医针挑疗法对哮喘模型小鼠肺组织miRNA-126和血清IL-4、IFN-g及IgE的影响,探讨其起效的可能机制。将30只6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、针挑组,每组10只。模型组、针挑组采用卵清蛋白致敏及激发制备哮喘小鼠模型,针挑组在此基础上采用壮医针挑疗法,针挑大椎、肺俞、定喘、风门、肾俞、脾俞,每日1次,7 d为1个疗程。疗程结束后取材,RT-PCR法检测肺组织miRNA-126表达,ELISA法检测血清IL-4、IFN-g及IgE水平。模型组miRNA-126表达水平显著高于对照组(＜0.01)。针挑组miRNA-126表达水平显著低于模型组(＜0.01)。与对照组比较,模型组血清IL-4和IgE水平均显著升高(＜0.01),而IFN-g水平显著降低(＜0.01)。与模型组比较,针挑组血清IL-4和IgE水平均显著降低(＜0.01),而IFN-g水平显著升高(＜0.01)。壮医针挑疗法能够下调肺组织miRNA-126表达,降低血清IL-4及IgE水平,上调血清IFN-g水平,恢复IL-4、IFN-g水平,纠正Th1/Th2失衡状态可能是其起效环节之一。

壮医药学;针刺;哮喘;挑治;小鼠

支气管哮喘是Th1和Th2细胞亚群细胞因子、各种免疫活性细胞综合作用的结果,以嗜酸性粒细胞浸润、气道高反应性(AHR)和血清IgE升高为特征[1]。研究[2]已经证实Th1/Th2细胞亚群的失衡是哮喘发病的核心环节。IL-4是促进Th0向Th2细胞分化的关键细胞因子[3],IL-4还可诱导B细胞产生IgE,在过敏性疾病炎症反应中起着重要作用[4],g干扰素(interferon- gamma,IFN-g)则是促进Th0细胞向Th1方向分化,并抑制向Th2方向克隆分化的主要细胞因子[5],能够显著抑制IL-4诱导的IgE的合成过程,从而减轻哮喘的炎症反应[6],推测IL-4和IFN-g之间的平衡对于Th1/Th2平衡有调节意义。微型RNA(Micro RNA,miRNA)参与细胞增殖、分化等功能的调节,近来在哮喘发病机制及作用受到关注[7-8],更早些的研究表明选择性抑制其中miRNA-126可以下调Th2细胞因子表达,减轻哮喘症状,是基因层面调控哮喘的一个重要分子[9]。本实验建立哮喘模型小鼠,观察壮医针挑疗法对哮喘模型小鼠肺组织miRNA-126和血清IL-4、IFN-g及IgE的影响,探讨壮医针挑疗法治疗哮喘的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与分组

6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠30只,体质量(24.68±8.14)g,合格证编号为SCXK(京)2013-0002。由本院科学实验中心购买并提供。小鼠按数字随机表法分3组,即对照组、模型组、针挑组,每组10只。实验中对动物的处理遵循相关动物使用伦理学原则。

1.1.2 主要试剂和仪器

乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司,批号20080610),氯仿(北京化学试剂公司,批号20110322),异丙醇(北京化学试剂公司,批号20100811),卵清蛋白(OVA)(Sigma,USA),IL-4检测试剂盒(上海森雄,批号20130021),IgE检测试剂盒(R&B公司,USA), IFN-g检测试剂盒(武汉博士德,批号000254),miRNA- 126引物、内参引物(Genecopia,USA),RNA逆转录kit (Gibcobrl公司),酶标仪(MK3型,Thermo Labsystem公司),凝胶成像系统(chemidoc XRS型), PCR仪(7900HT型,ABI公司),紫外分光光度仪(DU530型,Beckman公司),超低温冰箱(MDF-U72V型,日本三洋公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模与各组处理

造模方法参考Perrier等报道[10],模型组、针挑组第l、4、7、10、13天,每日1次,每次l mL(50mg/L)分别腹腔内注射OVA混悬液(含氢氧化铝400mg和OVA100mg)进行基础致敏,对照组以生理盐水代替。第14天将小鼠置于自制有机玻璃盒中,给予雾化吸入OVA(0.1 mol/LPBS稀释OVA1 mg),每次30 min,每日1次,连续l星期激发。哮喘模型制备评价指标参考李美容等[11]报道。

对照组以生理盐水雾化代替。针挑组第14天起,激发后1 h按照李忠仁主编的《实验针灸学》取穴大椎、肺俞、定喘、风门、肾俞、脾俞。腧穴皮肤常规消毒,采用消毒大号缝衣针将上述穴位作为针挑点,挑出皮下一些白色纤维组织,用消毒锐利陶瓷片割裂纤维(一般不出血),然后用针在该点垂直快速点刺,刺入皮下1 mm,点刺后以5%碘酒、75%乙醇消毒。每日1次,7 d为1个疗程。模型组和对照组不作特殊处理。共进行1个疗程针挑治疗。

1.2.2 取材

疗程结束后第1天,按5 mL/kgip20%乌拉坦麻醉并固定。眼球取血1.0 mL,离心(3000 r/min, 10 min)后收集并取右肺滤纸吸干,均﹣70℃保存待检。

1.2.3 RT-PCR法检测miRNA-126表达

取100mL肺组织匀浆,用Trizol试剂提取总RNA,氯仿和异丙醇抽提。紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA的浓度和纯度,取10mL根据逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA,﹣70℃冻存备用。取5mL逆转录产物进行PCR扩增反应,以通用引物为内对照miRNA-126引物(mmu-miRNA-126:F 5′-TGGAACCAGGAAGGCGGCACD-3,R5′-AACGTCCGTGGCCCCTGT-3′);has-miRNA-126:F5′-GTCCAGGAAGGCGGCACG-3,R5′-AGCGTCCGTGGCCCTTGCG-3′;内参引物: (5′-GCCGCTTCACGAATTTGCTGGTCGGACGC-3′,has-miRNA-126:5′-CGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG-3′,mmu-miRNA-126:5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA-3′)。各样品目的miRNA和内参分别进行real-time PCR反应。

1.2.4 IL-4、IFN-g和IgE的检测

ELISA法检测,按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 统计学方法

应用SPSS12.0统计软件,计量资料用均数±标准差表示,miRNA-126表达数据采用REST软件进行分析。组间比较采用单因素方差分析和检验,＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-126表达

模型组miRNA-126表达水平显著高于对照组(＜0.01)。针挑组miRNA-126表达水平显著低于模型组(＜0.01),趋近于对照组,与对照组比较差异无统计学意义(＞0.05)。详见表1。

表1 miRNA-126表达倍数比较 (±s)

注:与对照组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

2.2 血清IL-4、IFN-g和IgE水平

与对照组比较,模型组血清IL-4和IgE水平均显著升高(＜0.01),而IFN-g水平显著降低(＜0.01)。与模型组比较,针挑组血清IL-4和IgE水平均显著降低(＜0.01),而IFN-g水平显著升高(＜0.01)。与对照组比较,针挑组IL-4、IFN-g和IgE水平均有趋近趋势,差异没有统计学意义(＞0.05)。详见表2。

表2 IL- 4、IFN-g和IgE水平比较 (±s)

注:与对照组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

3 讨论

哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病,其临床特点是反复发作性喘息、胸闷、咳嗽等,缓解和发作交替,并有组织形态学上的气道梗阻和气道重塑表现[1],哮喘的病理特征是嗜酸粒细胞、T细胞、肥大细胞、中性粒细胞等长期浸润以及Th2细胞优势分化的免疫应答,突出表现为Th2型细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13与IgE的大量释放和水平升高[12]。

哮喘的治疗首选激素治疗,但在临床上我们观察到有部分患者对激素治疗无反应性,提示针对Th2细胞优势分化的免疫应答治疗需要在Th2细胞优势分化的上游调控机制中找到靶点从而找到新的治疗对策[13],在哮喘发病的调控机制中,miRNA的调控受到关注,miRNA的主要功能是在转录后水平调控与机体生长、发育、疾病发生相关基因的表达水平[14],miRNA-126是调控气道及肺组织相关基因表达的miRNA,研究证实抑制miRNA-126可以下调Th2细胞因子表达,减轻哮喘症状[9]。IL-4是最重要的Th2型细胞因子,对IgE的合成及释放均有关键作用,调控哮喘的炎症反应程度[6],IFN-g则是抑制向Th2方向克隆分化、减轻哮喘炎症反应的主要细胞因子[5],因此,IL-4和IFN-g可视为Th2和Th1最具有代表性的细胞因子,Th1/Th2平衡与IL-4和IFN-g的水平应有密切关系。

我们在临床上对哮喘患者采用壮医针挑疗法治疗,对治疗进行效果评价,主要观察患者喘息、咳嗽、咯痰、胸闷等症状和肺功能的改善,具体的疗效判定标准依据中华医学会呼吸病学分会哮喘学组支气管哮喘防治指南[15],实践中我们注意到对其中部分对激素治疗无反应的患者采用针挑疗法有一定的作用,结合上述关于miRNA的研究进展,我们推测miRNA-126对IL-4和IFN-g有调节作用并由此调控Th2分化和免疫应答。在本实验工作中,我们观察到哮喘模型,经过针挑治疗处理后,miRNA- 126表达水平显著降低,IL-4和IgE水平也均显著降低,而IFN-g水平显著升高,均接近对照组水平,提示miRNA-126有可能通过调节IL-4/IFN-g进而调控Th2分化和免疫应答。

壮医针挑疗法对哮喘、头痛、失眠等一些慢性病及疑难症有良好的疗效[16]。壮医针挑疗法以壮医理论为指导,壮医名家黄汉儒[17]认为挑刺可以激发人体正气,将郁滞体内的有形或无形之毒从体表针挑点驱出,疏通“龙路”、“火路”,使“水道”、“气道”、“谷道”畅通,天地人三气同步。如能从分子机制上阐明壮医针挑疗法治疗哮喘的机制,将会有助于这一治法的发扬和推广交流。

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Effect of Zhuang Nationality Medical Picking Therapy on miRNA-126, IL-4, IFN-gand IgE in Asthma Mice

-1,-1,-1,-2,-1,-1.

1.,533000,; 2.,533000,

To investigate the effect of Zhuang nationality medical picking therapy on lung miRNA-126 and serum IL-4, IFN-gand IgE in a mouse model of asthma and explore the possible mechanism by which it produces the effect on asthma.Thirty female SPF BALB/c mice aged 6-8 weeks were randomly allocated to control, model and picking therapy groups, 10 mice each. A mouse model of asthma was made by ovalbumin sensitization and challenge in the model and picking therapy groups. In addition, the picking therapy group received needle picking out treatment at Dazhui (GV14), Feishu (BL13), Dingchuan (Ex-B1), Fengmen (BL12), Shenshu (BL23) and Pishu (BL20) once daily, seven times as a course. The materials were taken after the end of treatment course. Lung expression of miRNA-126 was examined by RT-PCR. Serum IL-4, IFN-gand IgE levels were measured by ELISA.The expression of miRNA-126 was significantly higher in the model group than in the control group (＜0.01) and significantly lower in the picking therapy group than in the model group (＜0.01). Compared with the control group, serum IL-4 and IgE levels increased significantly and IFN-glevels decreased significantly in the model group (both＜0.01). Compared with the model group, serum IL-4 and IgE levels decreased significantly and IFN-glevels increased significantly in the picking therapy group (both＜0.01).Zhuang nationality medical picking therapy can down-regulate lung expression of miRNA-126, decrease serum IL-4 and IgE levels, up-regulate serum IFN-glevels and restore IL-4 and IFN-glevels. Correction of Th1/Th2 imbalance may be one of the links via which it produces the effect.

Zhuang nationality medicine; Acupuncture; Asthma; Picking therapy; Mice

1005-0957(2014)08-0769-03

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.08.0769

2014-02-20

广西高等学校优秀人才资助计划[桂教人(2011)40号]

唐汉庆(1976 - ),男,副教授,博士

窦锡彬(1978 - ),男,主治医师,硕士