溶血磷脂酸对失血性休克大鼠脏器损伤保护作用

高广荣，张 成，张雪峰

沈阳军区总医院普通外科，辽宁沈阳 110016

意外创伤后的失血性休克是导致伤员死亡的主要原因，及时的液体复苏是挽救伤员生命的最主要措施。在复苏过程中如何减轻因缺血再灌注所导致的脏器损伤，提高复苏疗效是目前临床和基础研究的重点。近年来研究发现，溶血磷脂酸可能利于休克的复苏。本文通过建立压力控制性失血性休克模型，采用复苏阶段药物干预的方法观察溶血磷脂酸是否对失血性休克器官损伤起到保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级成年雄性Wistar大鼠(体重280～310 g)30只，沈阳军区总医院动物实验室提供。Datex-Ohmeda S/5多功能监测仪(芬兰德恩公司)，压力传感器(新加坡 Biosensors International PET，Ltd)。ELISA试剂盒。

1.2 动物分组与模型制备 30只成年雄性Wistar大鼠随机分为3组，每组10只，分别为空白对照组(C)、失血性休克 +磷酸盐缓冲液(PBS)复苏组(S)、失血性休克+溶血磷脂酸(LPA)复苏组(L)。C组只进行外科插管操作，不进行失血性休克模型建立及复苏。S组和L组按照标准建立压力控制失血性休克模型［1］。以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔内注射麻醉。进行双侧股动脉及右侧股静脉插管(PE-50)。右侧股动脉用于监测血压，左侧股动脉用于放血，右侧股静脉用于复苏。所有外科操作均在无菌条件下进行。外科操作结束后经过15 min稳定期，然后记录基础平均动脉压(MAP)。建立模型时，通过左侧股动脉插管在10 min内抽血使MAP降至40 mmHg。抽出的血液储存在肝素化(7.5 U/ml)的无菌注射器内，储存于4℃冰箱中，待复苏时回输至大鼠体内。在休克观察的90 min内通过继续抽血或少量回输抽出的血液来维持大鼠MAP在40～45 mmHg。休克90 min结束后分别给予S组及L组静脉注射PBS 1 ml或LPA 1 mg，然后将抽出的血液及等体积生理盐水通过右侧股静脉在10 min内用微量输液泵回输至大鼠体内，连续观察240 min。各组大鼠在外科操作结束后持续测量直肠温度，如果直肠温度低于37℃，即开始用红外线灯照射大鼠腹部，在实验观察期间通过间断照射红外线灯维持大鼠直肠温度在37～38℃，直至实验结束。

1.3 标本留取 各组在失血性休克复苏后240 min处死大鼠，留取大鼠肺脏和肝组织2块，各100 mg，分别置于4%甲醛溶液及－80℃低温冰箱待测。留取血清3 ml置于－80℃低温冰箱待测。

1.4 样本检测 ELISA法检测血清TNF-α及肺组织MPO浓度，严格按照试剂盒说明书操作。自动生化分析仪测定血清 ALT、AST浓度。苏木素-伊红(HE)染色法检测大鼠肺组织病理改变。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，应用单因素方差分析进行检验。P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠存活情况 C组大鼠全部存活，S组大鼠有2只死亡，L组大鼠有1只死亡。

2.2 肺组织MPO含量(U/100 mg肺组织)变化S组和L组大鼠肺组织MPO含量均明显高于C组(P﹤0.05)。但L组大鼠肺组织MPO含量明显低于S组(P﹤0.05)。见图1。

图1 3组大鼠肺组织MPO含量变化

2.3 血清TNF-α含量变化(pg/ml) S组和L组大鼠血清中 TNF-α含量均明显高于 C组(P﹤0.05)。但L组大鼠肺血清中TNF-α含量明显低于S组(P﹤0.05)。见图2。2.4 血清ALT浓度(U/L)变化 S组和L组大鼠血清中ALT浓度均明显高于C组(P﹤0.05)。但L组大鼠肺血清中ALT浓度明显低于S组(P﹤0.05)。见图3。

图2 3组大鼠血清中TNF-α含量变化

图3 3组大鼠血清ALT含量变化

2.5 血清AST浓度(U/L)变化 S组和L组大鼠血清中AST浓度均明显高于C组(P﹤0.05)。但L组大鼠肺血清中AST浓度明显低于S组(P﹤0.05)。见图4。

图4 3组大鼠血清AST含量变化

2.6 肺组织病理学变化 通过石蜡切片可见，C组大鼠肺组织内无明显炎症细胞浸润，肺泡腔内未见渗出液。S组大鼠肺组织内可见大量炎症细胞浸润，肺泡内大量渗液。而L组肺内炎症细胞浸润程度明显轻于S组。

3 讨论

溶血磷脂酸(1ysophosphatidic acid，LPA)是膜磷脂经磷脂酶D和磷脂酶A降解生成的细胞间磷脂类信号分子，是一种结构最简单的水溶性甘油磷脂。LPA与其受体结合后具有刺激细胞增殖、迁移，促进血液凝固等广泛的生物学效应，体内多种组织细胞均产生LPA，血液循环的LPA水平主要由血小板的产生和释放来决定［2］。研究发现，LPA与心脑血管意外密切相关，动脉粥样硬化和脑梗塞患者体内LPA明显升高［3］。近几年研究发现，外源性LPA能够减轻因内毒素性休克所导致的大鼠肝损伤，抑制肝组织内TNF-α基因的表达，降低炎症因子的水平，利于内毒性休克的救治［4］。有研究发现，外源性LPA能够通过抑制肾小球细胞凋亡及抑制补体活性而减轻因缺血再灌注所导致的肾损伤，具有保护肾功能的作用［5］。以上研究证实，LPA具有减轻炎症反应的作用。

创伤失血性休克同内毒性休克一样，也能够刺激机体释放过量的炎症介质，使休克机体发生全身性炎症反应综合征，最终发生多器官功能障碍综合征［6］。目前LPA对失血性休克后的炎症反应影响报道较少，是否对失血性休克所导致的脏器损伤有保护作用有待进一步研究。

本次研究表明，失血性休克复苏后4h大鼠血清中ALT、AST浓度明显升高，提示出现了肝脏的缺血再灌注损伤，而复苏前静脉注射LPA组大鼠血清ALT、AST浓度较PBS组明显下降，表明LPA具有减轻因失血性休克复苏所造成的肝脏缺血再灌注损伤，利于休克的复苏。

作为中性粒细胞募集的标志，MPO是反映肺内急性炎症反应的常用指标。本次实验证实，失血性休克复苏后大鼠肺组织内MPO浓度明显升高，休克复苏前应用LPA组大鼠肺组织内MPO浓度显著降低。结果表明，LPA能够减轻失血性休克后肺组织内中性粒细胞的浸润，减轻炎症反应。本实验通过石蜡病理切片也证实LPA组大鼠肺组织内炎细胞浸润减少，肺泡腔内渗出明显减轻，肺间质水肿也明显减轻。以上结果均表明，LPA减轻了因失血性休克所导致的肺损伤。

TNF-α是重要的促炎因子，以往的研究已经证实TNF-α是失血性休克后机体早期释放的促炎因子，发挥着促炎作用，TNF-α的大量释放能够刺激机体释放更多的促炎介质，启动炎症反应，导致器官的严重损伤。减轻TNF-α的浓度将利于休克的复苏。本实验同时检测了大鼠血清中TNF-α的浓度，证实LPA组大鼠血清中TNF-α浓度明显降低，证实LPA能够抑制失血性休克大鼠体内的TNF-α的浓度，进而减轻炎症反应。

本次实验结果表明，应用外源性LPA能够减轻失血性休克复苏后所导致大鼠肝、肺等脏器损伤，减轻失血性休克后的炎症反应，利于休克的复苏。但尚不清楚LPA通过何种途径发挥抗炎作用及脏器保护作用，有待深入研究。

［1］Zingarelli B，Hake PW，O'Connor M，et al.Lung injury after hemorrhage is age dependent:Role of peroxisome proliferators-activated receptor gamma［J］.Crit Care Med，2009，37(6):1978 － 1987.

［2］Nilsson UK，Svensson SP，Grenegard M.Synergistic activation of human platelets by lysophosphatidic acid and adrenaline［J］.Haematologica，2002，87(7):730 －739.

［3］Ishii I，Fukushima N，Ye X，et al.Lysophospholipid receptors:signaling and biology［J］.Annu Rev Biochem，2004，73:321 －354.

［4］Murch O，Collin M，Thiemermann C.Lysophosphatidic acid reduces the organ injury caused by endotoxemia-a role for G-proteincoupled receptors and peroxisome proliferator-activated receptor-γ［J］.Shock，2007，27(1):48 －54.

［5］de Vries B，Matthijsen RA，van Bijnen AA，et al.Lysophosphatidic acid prevents renal ischemia-reperfusion injury by inhibition of apoptosis and complement activation［J］.AJP，2003，163(1):47－56.

［6］Zingarelli B，Sheehan M，Hake PW，et al.Peroxisome proliferatorsactivator receptor ligands，15-deoxy-delta(12，14)－ prostaglandin j2 and ciglitazone，reduce systemic inflammation in polymicrobial sepsis by modulation of signal transduction pathyways［J］.J Immunol，2003，171(12):6827 －6837.