血液肿瘤患者AHSCT前后外周血淋巴细胞亚群及细胞周期的变化*

谢治军 薛重重 杨丽萍

(粤北人民医院血液内科，广东 韶关 512026)

自体干细胞移植(AHSCT)是指对患者进行全身照射、化疗和免疫抑制预处理后，将自体的造血干细胞经血管输注给患者，使之重建正常的造血和免疫功能[1]。AHSCT供者来源无困难，亦无移植物抗宿主病，移植相关死亡率低，而且疗效优于常规化疗。本课题分析对比AHSCT前后早期外周血淋巴细胞亚群及细胞周期变化，初步了解AHSCT后早期免疫重建过程。

1 对象与方法

1.1对象 自2006年10月-2010年12月，共有21例接受了AHSCT，其中男11例，女10例，年龄19～67岁，其中2006年10月-2008年12月间6例为回顾性研究，而2009年1月-2010年12月间15例为前瞻性研究。诊断分别为慢性髓系白血病(CML)15例，急性髓系白血病(AML)3例， 多发性骨髓瘤(MM)3例。因随访时限的不同、患者在原发病复发时退出本研究等原因，研究对象在移植后1个月时21例；3个月时21例；6个月时18例；9个月时17例。正常对照为30例健康献血员，男18例，女12例，年龄17～59岁。

1.2淋巴细胞及其亚群的检测 用Beckman-Coulter公司的EPICS-XL型流式细胞仪进行荧光抗体标记检测。取接受AHCST患者及健康志愿者的新鲜抗凝血标本，测出淋巴细胞中各淋巴细胞亚群的百分比。与血细胞计数仪联用，得出各淋巴细胞亚群百分比后乘以淋巴细胞数量，得出各淋巴细胞的绝对浓度。所用单抗为CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56，均购自Immunotech公司。

1.3淋巴细胞细胞周期的检测 取受检者肝素抗凝静脉血1 ml左右，立即用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。使用FACS-Calibuer流式细胞仪，对样品进行单参数DNA含量分析。按细胞周期流式图所示:①S期细胞比率(SPF)：SPF(%)=[S÷(G0/G1-S+G2M)]×100%；② DNA指数(DNA index，DI)和DNA倍体分类：二倍体(diploidy,D)和异倍体(aneuploidy,AN)。③细胞凋亡(Apo)：在DNA直方图上，在二倍体G=G0/G1细胞峰前出现一个亚二倍体DNA含量的细胞峰为Apo峰。

1.4统计学分析 数值以均值±标准差表示，采用t检验，用SPSS18.0软件进行统计分析。

2 结 果

2.1AHSCT前后淋巴细胞各亚群的结果 AHSCT前血液肿瘤患者的CD3+CD4+细胞数低于正常。B细胞(CD19+细胞)、NK细胞(CD3-CD16+CD56+细胞)、 T细胞(CD3+细胞)、CD3+CD8+细胞在正常范围，各亚群细胞数的标准差数值均大于健康对照组。AHSCT后1个月时淋巴细胞总数明显低于正常，自AHSCT后3个月起，患者的淋巴细胞总数大致正常。AHSCT后的淋巴细胞各亚群的恢复均有所不同，详见表1。

2.2AHSCT前后外周血淋巴细胞细胞周期检测指标 血液肿瘤患者AHSCT前外周血淋巴细胞细胞周期指标中的APO、SPF均在正常范围。在AHSCT后SPF、APO在不同时间指标变化不一。受检者中未发现DNA异倍体细胞，均为二倍体，DI值为1.00，详见表2。

表1 AHSCT前后淋巴细胞各亚群的结果(/μl)

注：*P<0.05与健康对照组比较，**P<0.01与健康对照组比较。

表2 AHSCT前后外周血淋巴细胞细胞周期各项指标的检测情况

注：与健康对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨 论

患者接受AHSCT时疾病状态均处于完全缓解或部分缓解状态，其外周血淋巴细胞细胞受检者中未发现DNA异倍体细胞，淋巴细胞细胞周期分布正常，增殖活性和凋亡水平跟正常组无差别，在AHSCT前多数患者的淋巴细胞各亚群处于正常状态，但其数据分析显示，淋巴细胞各亚群的离散程度大于健康组，AHSCT前患者均接受多个疗程化疗，个体免疫系统对化疗耐受程度不一样，以及个体免疫系统化疗后的恢复能力不一样，所以AHSCT前患者淋巴细胞各亚群的分布情况个体差异较大。

AHSCT后由于rhG-CSF的作用，外周血WBC恢复正常时淋巴细胞总数仍低于正常。本研究患者淋巴细胞在AHSCT后1月远低于正常水平，其后快速恢复，在3月时已恢复正常。淋巴细胞较快恢复，但其中各亚群的恢复时间并不相同。在AHSCT后T细胞各亚群的恢复快慢不一，多数研究提示CD8+T细胞可在AHSCT后3～18个月，而CD4+T细胞的恢复多在1年以上[2]，AHSCT后早期CD4/CD8严重降低[3]。本研究患者呈类似规律，T细胞的恢复主要以CD3+CD8+细胞为主，在AHSCT后3个月时已恢复并明显高于正常，以后逐渐下降，AHSCT后9个月时恢复正常。虽然T细胞在AHSCT后9个月恢复，但CD3+CD4+细胞在AHSCT后9个月时均明显低于正常，其恢复需要更长的时间。

本研究中外周血淋巴细胞的SPF在AHSCT后1月明显高于正常，以后逐渐下降，到AHSCT后9月份降至健康正常人水平。SPF可反映淋巴细胞活化程度，结合以上淋巴细胞亚群恢复的情况，AHSCT后早期外周血淋巴细胞活化扩增有偏向性，以CD3+CD8+细胞活化扩增为主。扩增的CD3+CD8+细胞通过Fas/ FasL介导启动肿瘤细胞的死亡信号，导致Fas肿瘤细胞凋亡[4]。APO从侧面反映了抗肿瘤效应大小。AHSCT后6月时APO下降至正常，可能与机体抗凋亡因素增多有关。

综上所述，AHSCT后体内淋巴细胞的免疫重建：淋巴细胞总数、NK细胞、B细胞、T细胞、CD3+CD8+T细胞在AHSCT后早期较快恢复，其中T细胞总数(以CD3+CD8+细胞为主)是通过外周血淋巴细胞的快速增殖恢复，同时，扩增的淋巴细胞被认为可介导肿瘤细胞凋亡，有一定的抗肿瘤效应，可进一步清除体内残存肿瘤细胞，随着时间推移，机体的抗肿瘤效应减弱，而依赖胸腺输出的CD3+CD4+细胞数量在AHSCT后9月仍较少，CD3+CD4+细胞数量极少情况下，不能诱导免疫反应，反而诱导免疫耐受。AHSCT后早期，机体提供有利于免疫正应答的免疫微环境，为免疫治疗提供了契机，而且此阶段机体免疫功能缺陷，也提示免疫治疗的必要性。

[1] 薛重重，杨丽萍，徐新，等．血液肿瘤患者AHSCT后DC /CIK免疫治疗的疗效观察[J]．中华全科医学，2012，10(3) : 341-343．

[2] 施玲燕，刘继武，刘晓玲，等．CIK细胞实验研究及治疗肿瘤的临床疗效观察[J]．肿瘤基础与临床，2009， 22(2) : 141-143．

[3] 孙利敏，冯仲珉，朱成功．化疗对恶性肿瘤患者T细胞亚群影响的临床分析[J]．实用癌症杂志，2008，23(2) : 185 -186．

[4] 徐茂忠，徐昕，戴秋新，等．急性髓系白血病T淋巴细胞亚群及NK细胞的变化及其临床意义[J]．南通大学学报:医学版，2008，28(2) : 118-119．