淋巴细胞免疫疗法治疗习惯性流产的疗效及机制研究*

张业霞 李 睿 高 华 张佳伦 房震亚

(1.菏泽医学专科学校病原教研室，山东 菏泽 274000；2.曹县第二人民医院妇产科，山东 曹县 274400；3.菏泽市立医院妇产科，山东 菏泽 274030)

习惯性流产是指连续发生3次或3次以上的自然流产，是女性妊娠期常见并发症，其病因复杂，涉及遗传、免疫、解剖、内分泌、感染及胚胎畸形等多种因素，但仍有40%～60%为原因不明习惯性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。近年来的研究表明，大部分URSA可能与免疫异常有关，约80%的URSA患者存在封闭抗体(blocking antibody，BA)缺乏[1]。近年来国内外部分医院开始探讨用丈夫血淋巴细胞治疗不明原因习惯性流产，但经免疫治疗后封闭抗体产生与否、与妊娠结局之间有无相关性,不同学者观点各异[2]。为进一步探讨丈夫血淋巴细胞免疫治疗习惯性流产的疗效及其与封闭抗体之间的关系，本研究特选60例封闭抗体阴性不明原因习惯性流产病例进行免疫学治疗，探讨封闭抗体与妊娠结局之间的关系。

1 资料与方法

1.1标本来源 选择2009-2012年菏泽市各医院封闭抗体阴性不明原因习惯性流产病例60例，患者年龄22～37岁，平均27.2岁，流产次数3～ 6次，平均3.8次，所有患者均符合免疫治疗条件。①连续发生3次或3次以上的自然流产。②夫妻ABO、Rh血型相合，女方封闭抗体检测阴性；③夫妻染色体核型正常；④丈夫精液常规正常；⑤女方无生殖道畸形与感染、遗传疾病、自身免疫性疾病、内分泌疾病等；⑥丈夫肝、肾功能正常，无肝炎、HIV、梅毒等传染病。经过确切诊断后,对患者进行充分的解释和说明，让夫妻双方对免疫治疗有一定的了解和认识，对医生具有充分的信任感，在治疗过程中能保持良好心态，自愿积极配合治疗并签署知情同意书。另选40例封闭抗体阴性患者作为对照，采用常规方法保胎治疗，两组一般资料无统计学差异。

1.2方法

1.2.1封闭抗体检测 用ELISA法进行测定，分别于免疫治疗前后对患者血清进行封闭抗体检测，试剂来自北京索奥生物技术有限公司，具体操作严格按照试剂盒说明书完成。

1.2.2免疫治疗方法 无菌抽取丈夫肘静脉血20～30 ml,肝素抗凝,常规分离、浓缩提取淋巴细胞,每次注射细胞数( 2～3)×107个/ml，以类似青霉素皮试方法少量多次于妻子前臂掌侧皮内注射 5个皮丘,每个皮丘 0.2 ml，连续注射3次，每次间隔2周,即为一疗程。一般2个疗程，即孕前注射3次,在接受治疗的过程中，夫妻要避孕，一疗程结束后复查封闭抗体，阳转后鼓励患者尽早妊娠,发现怀孕后再注射3次,进行一疗程的巩固治疗，直至度过危险期；如封闭抗体仍为阴性则继续加强下一疗程的免疫治疗，直至封闭抗体转阳后再考虑受孕。治疗后6个月以上未妊娠者,再给予3～4次加强免疫尽量让其怀孕,对孕期治疗3次后仍有先兆流产症状的患者,再增强治疗2～4次。注射时间避开月经期或其他疾病急性期。每次治疗均按无菌操作进行，嘱患者妊娠后注意休息，避免早期频繁性生活，适当心理疏导以减轻精神压力，并认真观察妊娠早期反应。所有患者均建立档案, 定期回访。

1.2.3T细胞亚群及IgG、IgM检测 流式细胞术分析外周血T细胞亚群及IgG、IgM。严格按说明书要求完成标本采集、免疫荧光染色、标记、分析等各项操作。

1.2.4疗效判定 妊娠成功标准为成功分娩或妊娠3个月以上且B超检查无异常。

1.3数据分析 采用SPSS 15.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组患者分别治疗后妊娠结局分析 试验组经免疫治疗后妊娠成功率为81.7%，其中成功分娩26人，正在妊娠中23人，再次流产11人。而对照组经常规保胎治疗妊娠成功率只有37.5%，二者差异有统计学意义(见表1)。

表1 两组患者治疗后妊娠结局分析

注：两组成功率比较，χ2=18.45，P<0.01。

2.2试验组免疫治疗后封闭抗体阳性与阴性者妊娠结局分析 试验组60例患者经免疫治疗后，封闭抗体转阳数为51人，其中再次流产者5人，妊娠成功率90.3%；封闭抗体仍为阴性者9人，再次流产6人，妊娠成功率33.3%。封闭抗体阳性组与阴性组妊娠成功率有统计学差异(χ2=16.52，P<0.01)。

2.3试验组免疫治疗前后T细胞亚群及IgG、IgM检测结果 结果显示，患者外周血T淋巴细胞亚群有了明显变化。CD4+T细胞较治疗前下降，CD8+T细胞治疗后明显上升，CD4+T/CD8+T下降，IgG与IgM治疗后亦下降明显，各项指标免疫治疗前后均有显著性差异(见表2)。

表2 试验组免疫治疗前后T细胞亚群及IgG、IgM检测结果

2.4注射部位皮肤反应 密切观察患者注射局部皮肤反应，有无红肿硬结、水泡等。

3 讨 论

胚胎基因一半来自父方，一半来自母方，从免疫学观点看，妊娠是一个复杂的生理过程，胚胎是一个半非己的同种异体移植物，因此原因不明的习惯性流产可能与免疫排斥反应有关。近年研究表明，组织相容性抗原(HLA)在移植免疫中占有重要地位，夫妻间HLA抗原位点相似度越高，流产率越高，尤其是以DR抗原相似频率越高的流产几率越大[3]。在正常妊娠女性中, 由于夫妻间HLA抗原的非相容性, 胎儿所携带的位于滋养层细胞表面的父系HLA抗原能刺激母体免疫系统产生免疫应答, 妊娠妇女体内产生一种抗丈夫淋巴细胞的特异性IgG 抗体, 此种抗体即封闭抗体，它既可阻止母体免疫系统对胚胎组织发生排斥反应, 封闭母体淋巴细胞对胎盘滋养层的细胞毒作用，防止Th细胞识别胎儿抗原，阻断母体Tc细胞对胚胎的杀伤，保护胎儿、使妊娠正常维系，成为妊娠继续所必需的保护伞，又能与胚胎细胞上的抗原结合，阻断母体淋巴细胞到胚胎细胞的通路，使胚胎免受攻击，此外封闭抗体还可保护和刺激胎盘细胞的生长与分化，促进胚胎发育[4-6]。当夫妻HLA抗原高度相似时, 母体的免疫应答减弱,对胚胎父系抗原呈现免疫低反应性，很难产生更多的抗体，致使母体封闭抗体缺乏，母体对胚胎的免疫耐受被打破,排斥反应增强，妊娠早期就可能出现流产,晚期则可能会出现妊娠高血压、胎儿宫内生长迟缓等，甚至最终胎死宫内。

基于以上原理，目前国内外致力于研究采用丈夫或无关个体淋巴细胞对母体进行免疫治疗，诱导母体产生针对丈夫个别基因的抗体，即封闭抗体，通过这种免疫功能的改变及封闭抗体的介导，增强母体对胚胎的免疫保护，提高妊娠成功率。因此，本研究特选择100例封闭抗体阴性不明原因习惯性流产病例，其中60例进行淋巴细胞免疫治疗，并于治疗后复查封闭抗体、T细胞亚群和IgG、IgM含量的改变，另40例采用常规方法保胎治疗，对比两组妊娠结局，探讨封闭抗体与妊娠结局之间的关系。

本研究结果显示，试验组经免疫治疗后妊娠成功率为81.7%，与国内的文献报道相似( 70.0%～87.9%)[7]，而对照组经常规保胎治疗妊娠成功率只有37.5%，二者差异有统计学意义。试验组60例患者中，经免疫治疗后，封闭抗体转阳数为51人，其中再次流产者5人，妊娠成功率90.3%，封闭抗体仍为阴性者9人，再次流产6人，妊娠成功率33.3%，经统计，封闭抗体阳性组与阴性组妊娠成功率有统计学差异，可见封闭抗体阳性可大大提高妊娠成功率，有利于妊娠的继续维持。免疫治疗后虽然并非所有患者封闭抗体都转为阳性，但封闭抗体阳性组妊娠成功率远高于阴性组，封闭抗体的产生从一定程度上可预示妊娠结局，它可提示母体免疫耐受形成,易于胎儿存活。而妊娠失败的病例,可能是由于多种因素相互影响所致，其原因需要进一步探讨。本研究中我们对免疫治疗后妊娠成功的新生儿进行了出生时体重、生长发育、智力水平等方面的随访，均未发现异常，说明该种免疫治疗方法是安全可靠的。

为进一步了解患者免疫治疗前后免疫状态的改变，本研究特对治疗组免疫治疗前后T细胞亚群及IgG、IgM进行了检测，患者外周血T淋巴细胞亚群有了明显变化。结果显示，患者CD4+T细胞较治疗前下降，CD8+T细胞治疗后明显上升，CD4+/CD8+下降，IgG与IgM治疗后亦明显下降，各项指标免疫治疗前后均有显著性差异。一般认为, CD4+T和CD8+T细胞的调节对维持机体的免疫平衡至关重要，CD4+T细胞比率增加可强化母体细胞免疫功能,增强对胚胎的免疫排斥，对妊娠不利，而CD8+T细胞在免疫应答中起着负调节作用，它既可抑制体液免疫, 又可抑制由CD4+T细胞介导的迟发型超敏反应及增殖反应等, 从而有利于妊娠继续维持[8]。患者在治疗后IgG、IgM明显下降,这说明通过免疫治疗可改善机体的免疫状态, 患者的免疫调节趋于正常，提高了妊娠成功率。

在免验治疗实施过程中，我们密切观察患者注射局部反应，结果提示注射部位局部皮肤反应的轻重可预示免疫治疗效果，随着免疫治疗次数的增加，患者皮肤反应逐渐减轻，注射皮肤局部有红肿硬结甚或水泡者，妊娠结局预后良好，若局部皮肤反应不明显，一般妊娠预后不理想。

综上，对缺乏封闭抗体的习惯性流产母体进行免疫治疗，疗效肯定，方法简便，无不良反应，亦可减轻患者经济负担，值得在临床加强推广。

[1] 丁莉，周蕾.疫治疗不明原因习惯性流产对封闭抗体表达的影响及意义[J].中国现代医生，2012,50(2):27-28.

[2] 华月琴,陈瑞华,吴志南,等. 主动免疫治疗原因不明习惯性流产后外周血免疫球蛋白及T淋巴细胞亚群的变化[J].中国妇幼保健,2010,25(19):2697-2698.

[3] 张玉华.不明原因习惯性流产的主动免疫治疗[J].中外医疗，2010,27:47.

[4] 张晨光，朱琳琳，庞桂芝.淋巴细胞免疫治疗习惯性流产的临床疗效分析[J].中国输血杂志,2013,26(8):739-741.

[5] 吴美梅，孙丛萌，周运花.复发性流产免疫治疗疗效观察[J].实用医学杂志,2013,29(20):3363-3365.

[6] 龚护民，茹美燕，陈安琴.主动免疫联合安胎治疗原因不明习惯性自然流产临床研究[J].中国妇幼保健,2011,26(8):1186-1188.

[7] 黄剑婷,徐碧红,陈敏芝. 36例封闭抗体不足习惯性流产患者免疫治疗的临床分析[J].现代免疫学,2011,31(1):79-80.

[8] 周卫琴,沈宗姬,何琦.主动免疫治疗不明原因习惯性流产33例疗效分析[J].苏州大学学报:医学版,2010,30(2):388-391.