基于UPLC-代谢组学技术研究泽泻结合有氧运动对高脂血症大鼠的改善作用

苗 华，张 旭

(西北大学体育部，陕西西安 710069)

高脂血症是指各种原因导致的血浆中胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)和(或)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)过高和(或)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低的一种全身脂代谢异常[1]。高脂血症是一种严重威胁人类健康的疾病，是心脑血管疾病的重要病理基础，防治高脂血症是预防心脑血管疾病的有效措施，因而关于高脂血症发病机制和抗高脂血症药物的研究日益受到重视。代谢组学(Metabonomics或Metabolomics)是研究生物体受到刺激或扰动(如基因修饰、环境变化等)前后代谢产物图谱及其动态变化的一种技术[2]，可以帮助寻找疾病发展过程或治疗性干预的生物标示物[3]。近年来，代谢组学已被广泛应用于疾病诊断、药物疗效与药物作用机理、毒理学与安全性评价等研究方面。代谢组学技术在中药黄连素、银杏叶提取物、复方血府逐瘀汤等防治高脂血症的应用取得了一定的进展[4－7]。中药泽泻是多年水生或沼生草本植物。泽泻性寒，味甘、淡，归肾、膀胱经，具有利水渗湿、泄热通淋、化浊降脂等功效，可用于小便不利、热淋涩痛、水肿胀满等症，近代药理证明泽泻具有利尿、抑制动脉粥样硬化和抗肾结石的活性，同时还有解痉、保肝、抗炎、降低血压以及抗高血脂等作用[8]。本研究利用高脂血症大鼠为对象，基于UPLC-代谢组学技术和预防性给样法，探讨泽泻提取物联合有氧运动对实验性高脂血症大鼠脂质代谢紊乱的干预作用。

1 实验对象与方法

1.1 泽泻提取物(AR)

取3kg泽泻，粉碎，用稀乙醇加热回流提取，合并提取液，回收乙醇并浓缩至适量，加在已处理好的大孔吸附树脂柱上，依次用水及不同浓度的乙醇洗脱，收集相应的洗脱液，回收乙醇，喷雾干燥，或回收乙醇，浓缩成稠膏，真空干燥，粉碎，即得。

1.2 高脂血模型－预防性给样法

健康雄性SD大鼠40只，随机分成5组(8只/组)，A组(正常对照组)正常食料喂养;B组(高脂血症模型组)高脂饲料喂养;C组(高脂血症+AR组)高脂饲料喂养同时灌胃AR提取物10g生药/kg·d;D组(高脂血症+有氧运动组)高脂饲料喂养同时进行无负重游泳训练;E组(高脂血症+有氧运动+AR组)高脂饲料喂养同时灌胃AR 10g生药/kg·d，同时进行无负重游泳训练。实验时间为4周。

1.3 生化指标测定

第4周末大鼠经腹主动脉采血，3 000 r/min离心10 min，得上层血清。采用自动生化仪测定TC，TG，HDL-C及LDL-C等指标;采用试剂盒测定血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和脂质过氧化产物(MDA)测定。

1.4 代谢组学测定

美国Waters液相色谱仪;美国XevoTM飞行时间质谱;MassLynx V4.1工作站;Acquity UPLC HSS T3 column(2.1 mm ×100 mm，1.8 μm)色谱柱;流动相为0.1%的甲酸乙腈(A)－0.1%的甲酸水溶液(B);梯度洗脱程序:0～0.5 min，1%B;0.5～3.0 min，1% ～30%B;3.0～7.0 min，30%～99%B;7.0 ～8.0 min，99%B;8.0 ～10.0 min，99.0% ～1.0%B;流速为0.45 mL/min;自动进样器温度为4℃;进样量为2 μL。质谱条件:ESI正离子模式;毛细管电压和锥孔电压分别为3.5 kV和30 V;干燥气流速800 L/h;干燥气温度450℃。

1.5 统计学分析

所有数据用x±SD表示，两组间差异比较，采用t检验，P＜0.05表示统计学上存在显著性;P＜0.01存在非常显著差异。

2 结果

2.1 基于UPLC-代谢组学技术的药效学评价

为了能够更加清晰地识别不同时间段药效学细微变化，通常采用化学计量学的方法，基于UP-LC-代谢组学技术结合主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法(PLS-DA)等统计学方法对大批量的血清、尿液等数据进行聚类分析，通过数据分类与特殊离群点的寻找等过程，就可以轻松地发现不同组是否有差别。第4周采用PLS-DA处理不同组间比较的结果，可以观察到单一AR治疗组介于正常组和模型组之间，但更接近与模型组(图1A);单一有氧运动组几乎与模型组没有差别(图1B);AR结合有氧运动组介于正常对照组和高血脂模型组中间(图1C)。这些结果说明不仅AR结合有氧运动组对高脂血症有一定的治疗作用，而且二者结合的治疗效果优于单一AR组或有氧运动组。

图1 第4周大鼠高脂血症模+AR组(A)、高脂血症模+有氧运动组(B)及高脂血症模+有氧运动+AR组血清组(C)均值PLS-DA分析Fig.1 PLS-DA analysis of hyperlipidemia serum from AR(A)，aerobic exercise(B)and AR in combination with aerobic exercise(C)groups in the fourth week

2.2 样品对大鼠血清TC，TG，LDL-C和HDLC的影响

与正常对照组对比，高脂血症模型组的TC，TG和LDL-C都有较大的升高且存在统计学差异(见表1)。与模型组对比，AR组、有氧运动组和AR结合有氧运动组均能显著降低TC且存在统计学上的显著性差异;AR组和AR结合有氧运动组均能显著降低TG和LDL-C，且存在统计学上的显著性差异。与正常对照组相比，高脂血症模型组的HDL-C都有显著的降低，且存在统计学的显著性差异;AR组和AR结合有氧运动组均能显著升高HDL-C，且存在统计学上的显著性差异，其升高HDL-C的效果以AR结合有氧运动组的效果最为显著(见表1)。上述实验结果证明，AR，AR结合有氧运动可有效抑制高脂饮食大鼠血清TC，TG和LDL-C水平的升高，但没有显著影响HDL-C水平，联合作用的效果优于AR单一作用，这些与代谢组学的结果一致。

表1 不同治疗组对大鼠血清TC，TG，LDL-C和HDL-C的影响Tab.2 Changes of TC，TG，LDL-C and HDL-C in the different groups

2.3 样品对大鼠血清 SOD，GSH-Px，CAT和MDA的影响

与对照组相比，高脂模型组的SOD，GSH-Px和CAT的含量降低且存在统计学上的显著性差异，AR组和AR结合有氧运动组与高脂血症模型组比升高SOD和GSH-Px的含量存在统计学上的显著性差异;对于CAT，仅AR结合有氧运动组升高CAT的含量存在统计学上的显著性差异;有氧运动组有升高SOD，GSH-Px和CAT的含量的趋势，但没有统计学上的显著性差异。模型组的血清MDA含量显著升高，且存在统计学上的非常显著性差异，AR组和AR结合有氧运动组与高脂血症模型组比降低MDA的含量存在统计学上的显著性差异(见表2)。实验结果证明AR，AR结合有氧运动可有效抑制高脂饮食大鼠血清SOD，GSH-Px和CAT的含量降低和MDA的含量增加，联合作用的效果优于AR单一作用，这些与代谢组学的结果一致。

表2 不同治疗组对大鼠血清SOD，GSH-Px，CAT和MDA的影响Tab.2 Changes of SOD，GSH-Px，CAT and MDA in the different groups

3 讨论

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后系统生物学的又一重要分支，代谢组学覆盖了疾病诊断、药物作用机制、毒理学、营养学、微生物学、环境科学及植物学等方面。代谢组学的出现为中药疗效评价提供了全新的思路和工具，中药(尤其是复方)的整体性作用机制和疗效在系统代谢组学的研究方法下将可能得到充分的展示和挖掘。病理过程中代谢网络的某些环节出现紊乱，该过程使生物代谢网络、使细胞产生的内源性产物的种类、浓度、相对比例发生扰动，这种扰动体现在小分子代谢产物集合轮廓的改变。因此，通过比较正常组与模型组的代谢产物集合轮廓，可以从中得出两者内源性产物种类、浓度、相对比例是否处于相同范围，进而推断造模是否成功;通过比较正常组、模型组和治疗组的代谢产物集合轮廓，可以从中得出3者内源性产物变化趋势，进而推断药物对模型的治疗是否有效、对模型组的治疗程度、治疗组与正常组的接近程度等相关的变化。PLS-DA图显示高脂饮食大鼠血清代谢紊乱，这与用高脂食物喂养大鼠，大鼠TC，TG等升高，显示高脂血症症状一致。代谢组学已成为判断药理模型和药物药效是进展程度的新方法，代谢组学的图谱反映了不同治疗组治疗高脂血症的变化过程和改变的趋势，代谢组学结果说明不仅AR结合有氧运动组对高脂血症有一定的治疗作用，而且二者结合的治疗效果优于单一AR组或有氧运动组。

研究报道了泽泻提取物对高脂血症有较好的预防和改善作用[9－12]。泽泻能明显降低血清中的TC，TG和LDL-C，升高血清HDL-C水平，明显抑制主动脉内膜斑块的生成，预先给药则显示有预防作用[9]。泽泻水提醇沉物具有明显的降血糖和降血脂作用，并能保护胰岛组织免受损伤，泽泻水提醇沉物降低血糖作用与促进胰岛素的释放有关[10]。另外，泽泻提取物也有抗血小板凝集、抗血栓形成及增强纤溶酶活性等作用，能从降低血脂、抑制内皮细胞损伤、抗血栓等多方面抑制或减轻动脉粥样硬化的发生、发展。泽泻的乙酸乙酯提取物、乙醇浸膏的乙酸乙酯提取物等，对实验性高胆固醇血症家兔和大鼠都有降血脂作用。乙酸乙酯提取物和其不溶于醋酸中的残留部分作用最强。醋酸乙酯提取物每日口服1g/kg，对饲以普通饲料的正常大鼠亦有明显的降低胆固醇作用。用同位标记法证明。泽泻醇A有抑制小鼠小肠酯化胆固醇的能力，并可使胆固醇在大鼠小肠内的吸收率降低34%，但不影响亚油酸的吸收[9]。本实验发现 AR可以降低血清 TG，TC，LDL-C，升高血清HDL-C含量，这与文献报道结果一致。本研究显示AR和AR结合有氧运动能增加血清SOD，GSH-Px和CAT含量，同时下调血清MDA含量，AR结合有氧运动比单一的AR或有氧运动更好地改善机体的脂代谢紊乱。药物与有氧运动的结合可能是治疗高脂血症的一条有效途径。

4 结论

AR或AR结合有氧运动都可以有效地改善机体的脂代谢紊乱，降低血清中的TC，TG，LDL-C含量。联合作用的效果优于单一AR或有氧运动作用;AR配合有氧运动改善脂代谢紊乱的机制可能与抑制血脂异常、增加血清 SOD，GSH-Px，CAT，降低血清MDA等物质含量和活性有关。

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