复方丹参片中丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量测定

王蒙蒙,冯素香,李晓玉,周悌强,白 燕,吴兆宇

(河南中医学院药学系,河南郑州45000)

复方丹参片中丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量测定

王蒙蒙,冯素香*,李晓玉,周悌强,白 燕,吴兆宇

(河南中医学院药学系,河南郑州45000)

目的 建立复方丹参片中丹参酮ⅡA及丹酚酸B的高效液相色谱测定方法。方法 色谱柱为Venusil XBP C18(L)(4.6 mm×250 mm,5μm),丹酚酸B的流动相为:乙腈∶甲醇∶甲酸∶水(10∶30∶1∶59),检测波长为286 nm;丹参酮IIA的流动相为:甲醇∶水(85∶15),检测波长为270 nm。以外标法进行定量计算。结果丹参酮IIA和丹酚酸B分别在0.036 8～0.736μg和0.06～1.20μg范围内线性良好,平均加样回收率和RSD分别为98.41%、1.28%(n=9);98.29%、1.21%(n=9)。结论 该方法简便、准确、灵敏度高,重复性好,无干扰,可用于复方丹参片的质量评价及丹参制剂的质量控制。

复方丹参片;丹酚酸B;丹参酮IIA;高效液相色谱法

复方丹参片由丹参、三七和冰片组成,具有活血化瘀、理气镇痛作用,用于气滞血瘀所致的胸痹症、胸闷、冠心病心绞痛等治疗[1]。丹参的化学成分主要分脂溶性和水溶性两大类,其中脂溶性成分主要有丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮等,该类化合物有较强的抗心肌缺血、抗菌、抗雄性激素的生理活性。丹参中的水溶性成分主要有:丹参素、原儿茶醛、和丹酚酸A、B、C、D、E、F、G等,是丹参治疗冠心病的主要有效成分[2]。为提升复方丹参片的质量控制标准,保证制剂有效成分含量的稳定性和可靠性,对丹参片的质量标准进行了一系列规范研究,建立了采用高效液相色谱法测定复方丹参片中丹参酮ⅡA及丹酚酸B含量的方法,对有关丹参制剂质量标准的提升起到积极的促进作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪(2695高效液相泵, 2998紫外检测器,Empower 2工作站;美国waters公司);KH-2200DB型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);Sarterius BS 224S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);SHZ-D (Ⅲ)型循环水式真空泵 (巩义市予华仪器有限责任公司);HH-6型数控恒温水浴锅(上海比朗仪器有限公司);EYELA N-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。

1.2 试药

复方丹参片(批号:20120318;20120319; 20120320广州白云山和记黄埔中药有限公司);丹酚酸B(批号:111562-200605);丹参酮IIA(批号: 110766-200619)均购自中国食品药品检定研究院。

乙腈(HPLC级,Grace Company INC);甲醇(分析纯,天津四友精细化学品有限公司);甲酸(分析纯,天津鸥博凯化工有限公司);其他试剂均为分析纯,水为超纯水。

2 方法与结果

2.2 丹参酮ⅡA含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 Venusil XBP C18(L)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)(博纳艾杰尔科技有限公司),柱温:25℃;流动相:甲醇-水(85∶15);检测波长为270 nm。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于2 000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取丹参酮IIA对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每m L含40μg的溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品10片,精密称定,研细,取约1 g,精密称定,置具塞棕色瓶中,精密加入甲醇25 m L,密塞,称定重量,超声处理15 min(250 W,33 k Hz),放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,置棕色瓶中。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方量并以相同的工艺分别制备不含丹参阴性对照样品,照上述供试品溶液制备方法处理,得阴性对照溶液。

伟大的丢番图一生的六分之一是幸福的童年，24年后，他有了孩子，可惜的是，他的孩子只活了父亲寿命的一半。丢番图把丧子之痛转化为研究数学的动力，就这样又过了4年，他寿终正寝。

2.2.5 专属性试验 精密吸取对照品、供试品及阴性对照溶液各10μL,注入液相色谱仪进行测定。结果阴性对照色谱中,在与对照品及供试品色谱图对应保留时间处无相应色谱峰,表明其他组份对测定丹参酮IIA无干扰,结果见图1。

图1 丹参酮IIA HPLC色谱图A对照品(1丹参酮)IIA B供试品(1丹参酮IIA) C缺丹参阴性

2.2.6 线性关系考察 按以上色谱条件,分别用自动进样器进1、2、4、6、10、20μL的上述对照品溶液,记录色谱图。以浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,得线性回归方程Y=2.1E+5x-27 024,r2= 0.999 5.结果表明,丹参酮ⅡA进样量在0.036 8～0.736μg范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度试验 取同一对照品溶液,连续进样5次,每次10μL,记录丹参酮IIA峰面积,计算精密度的RSD为1.5%。表明仪器的精密度良好。

2.2.8 重复性试验 取复方丹参片样品5份,按2.2.2项方法制得供试液并按上述色谱条件测定丹参酮IIA的含量,计算RSD值为2.6%,表明重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量(丹参酮IIA约0.170 0 mg/g)的复方丹参片约0.5 g,共9份,精密称定,分为3组,每组分别加入质量浓度为0.167 5 mg/m L的丹参酮IIA对照品0.8、1.0、1.2 m L,照上述供试品溶液的制备方法及色谱条件进行测定,结果显示丹参酮IIA的加样回收率的RSD为1.28%,见表1。

表1 丹参酮IIA回收率实验结果(n=9)

由表可知,该方法测得的加样回收率平均值为98.41%,回收率的RSD≤3%,可知用该方法测试结果符合定量分析要求。

2.3 丹酚酸B含量测定2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 Venusil XBP C18(L)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)(博纳艾杰尔科技有限公司),柱温:25℃;流动相:甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59);流速∶1 m L/min;检测波长:286 nm。理论塔板数按丹酚酸B峰计算应不低于4 000。2.3.2 对照品溶液的制备 取丹酚酸B对照品适量,精密称定,加水制成每1 m L含60μg的溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品10片,精密称定,研细,取约0.15 g,精密称定,置50 m L量瓶中,加水适量,超声处理(300 W,50 k Hz)30 min,放冷,加水至刻度,摇匀,离心,取上清液。

2.3.5 专属性试验 精密吸取丹酚酸B对照品、供试品及阴性对照溶液各10μL,注入液相色谱仪进行测定。结果阴性对照色谱中,在与对照品及供试品色谱图对应保留时间处无相应色谱峰,表明其他组份对测定丹酚酸B无干扰,见图2。

图2 丹酚酸B HPLC色谱图A对照品(1丹酚酸B) B供试品(1丹酚酸B) C缺丹参阴性

2.3.6 线性关系 按以上色谱条件,分别用自动进样器进1、2、4、6、8、10、20μL的上述对照品溶液,记录色谱图,以浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,得线性回归方程Y=281 71x-1 031.9,r2= 0.999 6。结果表明,丹酚酸B进样量在0.06～1.20μg范围内线性关系良好。

2.3.7 精密度试验 取同一对照品溶液,连续进样5次,每次10μL,记录丹酚酸B峰面积,计算RSD为1.3%,表明仪器的精密度良好。

2.3.8 重复性试验 取复方丹参片样品5份,按2.3.2项方法制得供试液并按上述色谱条件测定丹酚酸B的含量,计算RSD值,样品的RSD为1.8%,重复性较好。

2.3.9 加样回收率试验 取已知含有量(丹酚酸B约8.840 mg/g)的复方丹参片约0.075 g,共9份,精密称定,分为3组,每组分别加入质量浓度为8.755 mg/m L的丹酚酸B对照品0.8、1.0、1.2 mL,照上述供试品溶液的制备方法及色谱条件进行测定,结果显示的丹酚酸B加样回收率的RSD为1.21%。见表2。

由表可知,该方法测得的加样回收率平均值为98.29%,回收率的RSD≤3%,可知用该方法测试结果符合定量分析要求。

表2 丹酚酸B回收率实验结果(n=9)

2.4 样品的测定

取3批复方丹参片样品(20120318,20120319, 20120320),每批取6份,照2.2.1及2.3.1项下供试品溶液制备方法制备,2.2.3及2.3.3项下HPLC色谱条件测定,记录色谱峰面积并计算,测定结果见表3。

表3 复方丹参片样品含量测定结果

3 讨论

复方丹参片为中药复方制剂,片剂含量测定时供试品溶液制备方法主要有超声、回流[3]。该实验对这两种提取方法进行了比较,超声提取丹参酮IIA和丹酚酸B的平均质量分数分别为1.112 mg/g、54.05 mg/g,RSD分别为2.35%、1.63%;回流提取丹参酮IIA和丹酚酸B的平均质量分数分别为1.243 mg/g、54.15 mg/g。RSD分别为2.06%、1.83%。结果表明,采用超声和回流方法提取含有量相近,无显著性差异。超声提取操作简便,因此选择超声处理作为供试品溶液的制备方法。

复方丹参片由于疗效显著价格低廉,被广泛运用于临床[4]。我们通过HPLC方法对复方丹参片样品中的丹酚酸B和丹参酮IIA进行含量测定,更全面、科学、合理地对丹参提取物进行质量评价和控制,有利于保证产品质量及临床疗效。建立了复方丹参片中丹酚酸B和丹参酮IIA的含量测定方法,该法灵敏度高、专属性强、重现性好,可作为复方丹参片的质量控制手段。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:化学工业出版社,2005:904-905.

[2]王丽萍.高效液相色谱法测定复方丹参片中丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量[J].医药导报,2007,10(26):1 215-1 216.

[3]郑琴,胡鹏翼,杨明,等.丹参制剂中丹参不同提取方法的合理性评价[J].中国药房,2011,22(35):3 293-3 295.

[4]秦健,吴孟岚.复方丹参片质量分析[J].中国药事,2006, 20(12):746-749.

[责任编辑 李武营]

Determination of the content of Compound Salvia Tablet salvianolic acid B and tanshinone IIA

WANG Mengmeng，FENG Suxiang*，LI Xiaoyu，ZHOU Diqiang，BAI Yan，WU Zhaoyu
（Henan University fo tradtional Chinese Medicine Deparement of Pharmacy，Zhengzhou，Henan 450000，China）

Objective Establish a determination of the content of Compound Salvia Tablet salvianolic acid B and tanshinone IIA by High performance liquid chromatography.Methods The column was Venusil C18（L）（4.6 mm ×50 mm，5μm），mobile phase of the Salvianolic acid B was Acetonitrile Methanol formic acid water（10∶30∶1∶59），the detective wavelength at 286nm.mobile phase of the tanshinone IIA was Methanol water（85∶15）and the detective wavelength at 270 nm，both of the injection volume were 10μL.Outside the standard method for quantitative calculation.Results Tanshinone IIA and salvianolic acid B in 0.036 8-0.736μg and 0.06-1.20μg good linearity in the range，The average recovery and RSD were 98.41%，1.28%（n=9）；98，29%，1.21%（n= 9）.Conclusion The experimental method has the characteristics of fast and effective sample pretreatment and short of Sample analysis time The method is simple，accurate，high sensitivity，good repeatability and no interference. Can be used for control the quality of Compound Salvia Tablet and Salvia miltiorrhiza preparation.

Compound Salvia Tablet；acid B；tanshinone IIA；HPLC

R927.2

A

1672-7606(2014)02-0108-05

2014-03-12

王蒙蒙(1990-),女,河南郑州人,硕士研究生,从事中药质量分析与新药研究工作。

*通讯作者:冯素香(1971-),女,河南郑州人,博士,硕士生导师,副教授,从事中药质量分析与新药研究工作。