升降二丹抗肿瘤作用的研究

李 红,戚笑笑,李依芃,杜钢军*

(1.河南大学药学院药物研究所,河南开封475004;2.河南大学生命科学学院,河南开封475004)

升降二丹抗肿瘤作用的研究

李 红1,戚笑笑1,李依芃2,杜钢军1*

(1.河南大学药学院药物研究所,河南开封475004;2.河南大学生命科学学院,河南开封475004)

目的 研究升降二丹对小鼠体表肿瘤的治疗作用。方法 建立小鼠肝癌H22、肺癌lewis皮下移植肿瘤模型和小鼠乳腺癌模型,通过小鼠存活期、肿瘤体积、肿瘤抑制率、脏器指数等考察升降二丹对小鼠体表肿瘤生长的影响;用MTT法观察升降二丹对lewis肿瘤细胞增殖的影响;ELISA法检测瘤组织TNF-α及CEA含量,初步探讨升降二丹的抗肿瘤机制。结果 升降二丹能使小鼠体表肿瘤逐渐缩小,延长荷瘤小鼠生存时间,阻止小鼠肿瘤自发转移,增加肿瘤组织TNF-α,减少肿瘤组织CEA;体外实验,升降二丹在高浓度可抑制肿瘤细胞的增长。结论升降二丹有明显的抗体表肿瘤作用,其机制可能与增加肿瘤组织TNF-α含量和减少肿瘤组织CEA含量有关。

升降二丹(红升丹;白降丹);TNF-α;CEA;MTT

中药在改善肿瘤患者的体质、降低化疗药物的毒性、增强化疗药物的疗效方面独具特色[1]。升降二丹是中医外科常用来提脓、祛腐的主药,首载于明代陈实功[2]的《外科正宗》。升降二丹因效果灵验,称为灵药,是外科圣药,具有搜脓、拔毒、祛腐、生肌的功效。现代医学认为,红升丹除了传统的提脓、祛腐作用外,还具有消肿、散结功能。

在中医学术史上,癌瘤曾经作为痈疽的一种,一般都是借鉴痈疽的治疗方法。当代中医也有人认为,癌瘤即为癌毒,可参考疡科古法诊治[3]。张兰凤等人运用“循经移疮泄毒”治疗癌肿,特别是对晚期肝癌患者循足厥阴肝经在“膝关”穴实施移疮泄毒,结果发现,在疱液中检出高于血清浓度的癌胚抗原(CEA)等物质。浦鲁言等人还对“循经移疮泄毒法”治疗晚期癌肿机理进行了探讨,认为采用循经移疮泄毒法治疗晚期癌肿是一种极具临床应用价值的辅助疗法。

目前,国内外升降二丹抗肿瘤活性的研究报道相对较少。传统中药用药经验认为,白降丹多用于提毒排脓,红升丹多用于化腐生肌。我们认为,升降二丹可取长补短,既能将瘤毒引至体表,又能将之消散于无形。本文用小鼠肝癌H22、肺癌Lewis皮下移植模型和小鼠乳腺癌模型观察了升降二丹对小鼠体表肿瘤的治疗作用。

1 材料

1.1 药品与试剂

红升丹、白降丹:湖北省汉川北桥银珠厂产品。

动物实验:外用,取原生药材红升丹、白降丹各1 g,凡士林20 g,混合均匀制成涂抹药膏,备用;内服,取原生药材红升丹、白降丹各1 g,体积分数0.5% CMC-Na溶液(本实验室自己配制)40 m L,混成均匀溶液。

细胞实验:取原生药材红升丹、白降丹各1 g,用PEG 400 10 m L溶解,无菌滤器过滤,滤液无菌密封备用。

TNF-α和CEA ELISA试剂盒(深圳晶美公司提供,进口分装);DMEM培养液(本实验室配制);胎牛血清、PBS(本实验室配制);胰酶、Tris-氯化铵裂解液、MTT、体积分数为0.5%CMC-Na溶液(本实验室配制);DMSO(本实验室配制);生理盐水(本实验室配制)。

1.2 动物和细胞株

昆明种小鼠,雌性,体质量20±2 g,河南省医学实验动物中心提供(合格证号:豫动合字101号); C57BL/6,雌性,体质量20±2 g,北京维通利华实验动物有限公司提供;H22肝癌,本实验室昆明鼠腹水传代保存;lewis肺癌和4T1乳腺癌细胞株,中国科学院上海细胞库提供,本实验室保存。

1.3 仪器

HDL洁净台(北京东联哈尔仪器制造有限公司);快速混匀器SK-1(常州国华电器有限公司); El X800酶标仪(美国BIO-IEK公司);TDL-508台式离心机(上海安亭科学仪器厂);YN-ZD-2电热蒸馏水器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂);CHA-S恒温振荡器(常州国华电器有限公司); BD-400冰柜(河南冷柜厂);电子天平FA1004N(上海精密仪器有限公司)。

2 方法

2.1 升降二丹对昆明小鼠肝癌H22移植性肿瘤生长的影响

无菌条件下,取昆明小鼠体内传代的H22肿瘤细胞,加无菌生理盐水1∶7稀释。于小鼠右后肢背部接种0.2 m L/只。次日将荷瘤小鼠随机分为模型组(体积分数0.5%CMC-Na溶液0.2 m L/10 g)和给药组(升降二丹1 g/kg)。灌胃给药,每日2次。待肿瘤长出,隔天称量小鼠体质量,每隔一天用游标卡尺测肿瘤长径、短径1次。约3周后处死小鼠,剥离肿瘤、肝脏、脾脏和胸腺,并称重。计算肿瘤抑制率及肝脏、胸腺、脾脏指数。

肿瘤体积(cm3)=肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度/2;抑瘤率(%)=(正常对照组瘤质量均值-用药组瘤质量均值)/正常对照组瘤质量均值×100%;脏器指数%=脏器质量均值(mg)/处死当日体质量均值(g)×100%。

抑瘤率＞30%,P＜0.05,为抗肿瘤有意义。

2.2 升降二丹对C57BL/6小鼠Lewis肺癌自发肺转移的影响

将在体小鼠Lewis肺癌实体瘤组织用组织匀浆器制备单细胞悬液,原液按1∶7稀释。0.2 m L/只接种于20只C57BL/6小鼠尾静脉,建立小鼠Lewis肺癌自发肺转移模型。将C57BL/6小鼠随机分为模型对照组和升降二丹治疗组。每组10只小鼠。模型组按小鼠体质量给体积分数0.5%CMC-Na溶液0.2 m L/10 g,2次/d,升降二丹治疗组按小鼠体质量灌胃升降二丹1 g/kg,2次/d。治疗28 d后次日处死小鼠,切离肺脏,称重。将称重后的肺组织以体积分数10%福尔马林(PBS)固定24 h,再用生理盐水冲洗,计数肉眼可见各组肺癌转移结节总数(个/每片)。

2.3 升降二丹凡士林药膏对昆明小鼠移植性肿瘤生长的影响[4]

在无菌条件下,取昆明小鼠体内传代的H22肿瘤细胞,加无菌生理盐水按1∶7稀释。于小鼠右后肢背部接种0.2 m L/只。次日将荷瘤小鼠随机分为模型对照组(涂抹凡士林膏)和升降二丹组(涂抹红升丹、白降丹凡士林药膏)。涂抹给药,4次/d。待肿瘤长出,每隔一天称量小鼠体质量,2次/周用游标卡尺测肿瘤长径、短径一次,观察肿瘤生长的外观变化以及小鼠生存期。

2.4 升降二丹对lewis肺癌细胞生长的影响[5]

将lewis小鼠肺癌传代细胞用胰酶-EDTA (2∶1)消化液消化(CO2培养箱中温育消化)3 min。将消化后的细胞混悬液离心5 min,1 000 r/min,取细胞用含体积分数为10%小牛血清的DMEM完全培养液洗2遍,再用完全培养液调整细胞浓度,制成单细胞悬浮液,调整细胞浓度,点96孔板,100μL/孔,5 000个细胞/孔。过夜贴壁。配药物浓度,每个浓度4个复孔,点板加药,100μL/孔。48 h后去除96孔板内药液,加入MTT,4 h后加DMSO,置于酶标仪570 nm测OD值。

肿瘤抑制率=(1-给药组OD值/对照组OD值)×100%。

2.5 升降二丹对昆明小鼠皮下移植性肝肿瘤组织TNF-α及CEA的影响

取生长良好的荷肝癌昆明小鼠,抽取其腹水,用生理盐水稀释8倍,用此腹水稀释液给20只雌性昆明小鼠一次性右后肢背部皮下注射(0.2 m L/只),建立肝癌模型。待肿瘤长出直径8～10 mm时,将荷瘤小鼠随机分为模型组和升降二丹组,每组10只小鼠。模型组瘤部涂不含药基质凡士林2次/d,升降二丹组瘤部涂含红升丹、白降丹的凡士林膏4次/d,间隔4 h。治疗14 d后次日处死小鼠,剥离肿瘤,低温匀浆裂解组织后,离心取上清,用ELISA法检测TNF-α及CEA含量。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 升降二丹对昆明小鼠移植性肿瘤生长的影响

与模型组相比,给药组小鼠的生存期有所延长,见图1;对H22荷瘤小鼠体质量的影响,见图2;对H22荷瘤小鼠皮下肿瘤大小的影响,见表1;升降二丹对H22荷瘤小鼠肿瘤的生长有抑制作用,见图3;对H22荷瘤小鼠脏器指数有一定的影响,其中对脾脏指数影响最明显(P＜0.01),见表2。

图1 升降二丹对H22荷瘤小鼠存活时间的影响

图2 升降二丹对H22荷瘤小鼠体质量的影响

表1 升降二丹对H22荷瘤小鼠皮下肿瘤大小的影响

图3 升降二丹H22荷瘤肿瘤生长的影响

表2 升降二丹对H22荷瘤小鼠脏器指数的影响

3.2 升降二丹对C57BL/6小鼠Lewis肺癌自发肺转移的影响

与模型组相比,升降二丹组能使荷Lweis小鼠体表肿瘤逐渐缩小,延长荷瘤小鼠生存时间,阻止小鼠肿瘤自发转移,见图4、图5。

图4 升降二丹对荷Lewis肺癌小鼠自发转移的影响

图5 升降二丹对荷Lewis肺癌小鼠肺转移结节的影响

3.3 升降二丹对lewis肺癌细胞增值的影响

实验结果显示,升降二丹在一定范围内可以抑制肿瘤细胞的增长,见表3。

3.4 升降二丹对小鼠H22皮下移植性肝肿瘤组织TNF-α及CEA的影响

实验结果显示,升降二丹能增加肿瘤组织TNF-α含量,减少肿瘤组织CEA含量,见图6。

表3 升降二丹对lewis肺癌细胞的抑制率

图6 升降二丹对小鼠H22皮下移植性肝肿瘤TNF-a及CEA的影响

4 讨论

中药的抑瘤率大于30%,并经统计学处理有显著性差异时,可继续实验,连续3次实验,疗效稳定,则评价此药有一定的疗效[6]。本实验中,升降二丹能明显影响瘤质量,使其指数下降(P＜0.01),抑瘤率为38.46%,显示有明显的抑瘤作用;升降二丹能使小鼠体表肿瘤逐渐缩小,延长荷瘤小鼠生存时间,阻止小鼠肿瘤自发转移,增加瘤组织TNF-α含量,减少瘤组织CEA含量,对小鼠体表肿瘤有明显的治疗作用;升降二丹能明显减少小鼠肺部结节数,显示对小鼠移植性肿瘤的转移具有一定的抑制作用。体外实验中,用不同浓度红升丹、白降丹作用于lewis肺癌细胞,一定浓度范围内对lewis细胞的生长有明显的抑制作用。

升降二丹属于重金属类,是外科圣药,具有搜脓、拔毒、祛腐、生肌的功效。中医认为,癌是痈疽的一种,治疗方法可借鉴痈疽治法[7]。当代中医也有认为,癌瘤即为癌毒,可参考疡科古法诊治。长期以来,人们一直认为机体的免疫系统在肿瘤演进的过程中能够清除肿瘤、保护自身,随着研究的逐步加深越来越多的证据表明,肿瘤浸润的免疫细胞不但不能发挥抗肿瘤作用。反而会促进肿瘤生长、侵袭与转移[8]。因此,降低因肿瘤而变大的脏器指数,反而更有利于增加小鼠的存活率。这可从升降二丹对小鼠免疫器官的影响中得到验证。本试验中脏器指数均有所下降,而以脾脏指数最为明显(P＜0.01)。这可能与升降二丹能减小因肿瘤而肿大的脾脏、胸腺等有关。

现代医学肿瘤的治疗仍处于综合治疗的时代,在循证医学指导下的个体化的综合治疗是当今的标准治疗方案,多采用以手术为主的综合治疗,即手术、放疗、化疗、生物治疗及分子靶向治疗等。放疗、化疗的毒副作用影响患者存活率,对晚期患者出现的并发症(如癌热、癌痛、骨相关事件、恶液质等)疗效欠佳,治愈率不高。现代医学的总体治疗有效率约为30%～50%,也就是说约有一半的患者还无法治愈,且近年来治疗进展较缓慢[9],因此,探求新理论、新观念、新技术就显得格外迫切。

中医药治疗恶性肿瘤有数千年历史,有确切的疗效,是我国肿瘤治疗的特色之一。可以提高患者生活质量,延长患者带瘤生存期,对放疗、化疗具有曾敏减毒作用。升降二丹能使小鼠体表肿瘤逐步缩小,延长荷瘤小鼠生存时间,阻止小鼠肿瘤自发转移,明显抑制体表自发性肿瘤的生长。机制可能与增加瘤组织TNF-α含量,减少瘤组织CEA含量有关,对其作用机制进行更加深入的研究,对探求新理论、新观念、新技术治疗肿瘤,改善治疗肿瘤的传统方法有重要意义。

[1]Papazisis K T,Kalemi T G,Zambouli D,et a1.Synergistic effects of protein tyrosine kinase inhibitor genistein with camptothecins against three cell lines in vitro[J].Cancer Lett,2006,233(2):255-256.

[2]刘晶,张毅.红升丹的研究进展[J].中医外治杂志,2009, 18(1):57-58.

[3]李燕,吴新明,钟非,等.移毒法的初步研究[J].中国中医基础医学杂志,2011,17(10):1 126-1 128.

[4]陈荣明.小鼠皮肤创面外用红升丹及其制剂对肾脏的毒性和机理初探[J].南京中医药大学学报,1995,11(2):73-75.

[5]杜钢军,林海红,许启泰.灯盏花素促进阿霉素诱导的K562细胞凋亡[J].中国药理学通报,2007,23(8): 1 043-1 047.

[6]杨培国,赵晶,张辉.松茸多糖化学组分及药理作用研究[J].长春中医药大学学报,2008,24(4):374-375.

[7]杜钢军,时小燕.治疗癌症的新途径:靶向肿瘤微环境[J].国际药学研究杂志,2011,38(5):336-340.

[8]郭勇.中医肿瘤治疗方法学探讨[J].浙江中医药大学学报,2009,33(5):703-708.

[9]羌曹霞.循经移疮泄毒法治疗晚期肝癌21例临床观察[J].新中医,2011,43(4):62-63.

[责任编辑 时 红]

Study of hydrargyrum oxydatum grudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum on anti-tumor

LI Hong1，QI Xiaoxiao1，LI Yipeng2，DU gangjun1*
（1.Institute of Pharmacy，Pharmaceutical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Life science college of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

Objective To study the anti tumor effects of hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum.Methods The transplanted tumor models of mouse H22，4T1 and lewis were established and the antitumor activity of hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum was observed by the survival tumor size，tumor inhibition rate，organ index.The effects of hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum lewis tumor cells were examined by MTT method in vitro.The mechanism by which hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum showed the anti-tumor effects was explored by examining TNF-αand CEA levels in tumor tissue using ELISA. Results Hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum reduced tumor size，prolonged mouse survival time，prevented tumor metastasis，increased TNF-αlevel in tumor，and decreased CEA level in tumor.In vitro，hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum at high concentration can inhibit tumor cell growth.Conclusion Hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum has anti-tumor effect on skin tumor，and its mechanism might be related to increasing TNF-αand reducing CEA in tumor cells.

red upborne elixir with calomel；TNF-α；CEA；MTT

R285.5

A

1672-7606(2014)02-0077-05

2013-09-30

国家自然科学基金项目(81173094);河南省高校青年骨干教师项目(2010GGJS-025);河南省科技厅重点攻关项目(112101310308);河南大学省部共建项目(SBGJ090704)。

李红(1988-),女,河南商丘人,硕士研究生,从事中药抗肿瘤药理学研究工作。

*通讯作者:杜钢军(1971-),男,博士,教授,从事中药抗肿瘤药理学的研究工作。