登革2型病毒NS3蛋白具有抑制病毒复制的作用

朱碧青，郑学礼

登革热是由登革病毒（DENV）引起的一种严重的虫媒病毒性传染病，主要在热带、亚热带地区流行［1］。据报道，全球约有25亿人受到登革热感染的威胁［2］。然而目前尚无特异有效的登革疫苗和抗病毒制剂［3］。

登革病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），其基因组为单股正链RNA，长约11 kb，共编码3种结构蛋白（C、prM、E）和7种非结构蛋 白 （NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5）［4］。其中NS3蛋白是一种亲水性的多功能蛋白，分子量（Mr）约为69kDa，含618个氨基酸，具有蛋白酶、RNA解旋酶和RNA聚合酶活性，在病毒的复制和成熟过程中起作用［5］。NS3蛋白含有蛋白酶和解旋酶两个结构域，具有良好的免疫原性，可诱导机体产生B、T细胞应答［6］。已有研究表明，NS3蛋白在病人和受试者体内可诱导产生较好的免疫反应，登革病毒NS3已成为有效的抗病毒靶标［7］。本研究目的在于构建DENV非结构蛋白NS3及其结构域的重组蛋白，并对其活性作初步鉴定，为登革疫苗的研制打下实验基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株、质粒及细胞 DENV-2（新几内亚株）和大肠杆菌DH5α为本实验室保存。载体pcDNA3.1（＋）由中山大学附属肿瘤医院实验室所赠。幼仓鼠肾细胞（BHK-21）为本实验室保存。

1.2 试剂 Trizol和Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自美国 Omega Bio-Tec公司；逆转录酶、PFU聚合酶、快速限制性内切酶、DNA Marker、pMD 18-T Vector试剂盒、实时定量PCR试剂盒等均购自大连TaKaRa公司；抗NS3兔多克隆抗体（SAB2700181）购自德国的Sigma公司；FITC标记的羊抗兔IgG和HRP标记的羊抗兔IgG均为SantaCruz公司产品；PVDF膜、Electrochemiluminescence（ECL）试剂盒均购自Bio-Rad公司。

1.3 目的基因的扩增 根据DENV-2NGC病毒株基因组序列（GenBank：NC-001474）设计引物如下：扩增非结构蛋白NS3及其结构域NS3P、NS3H的基因序列（图1）。使用pfu聚合酶进行PCR扩增：94℃2min；然后以92℃1min、55℃1min、72℃2min进行30个循环，再72℃延伸5min。

图1 DENV-2-NS3、DENV 2-NS3蛋白酶（NS3P）区 域 及DENV-2-NS3解旋酶（NS3H）区域结构示意图Fig.1 Schematic representation of DENV 2-NS3，NS3Pand NS3H

1.4 重组表达载体的构建 用快速性内切酶EcoR V和XbaI分别双酶切真核表达载体pcDNA3.1（＋）和PCR产物，分别使用凝胶回收试剂盒及产物纯化试剂盒回收纯化目的片段，于4℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，随机挑取克隆，经菌液PCR筛选阳性克隆，送Invitrogen公司测序，将读码框正确的重组质粒命名为pcNS3P、pcNS3H和pcNS3（见表1）。使用质粒提取试剂盒提取质粒，紫外分光光度计（Nanodrop2000）测定浓度用于转染。

表1 登革病毒NS3蛋白酶、解旋酶和全长的引物序列Tab.1 Primers of NS3protease，NS3helicase and NS3full-length

1.5 转染 2×104个/孔的BHK-21细胞培养于含10%FBS的DMEM完全培养基中，待细胞在6孔板中长满单层时，将4μg重组质粒及空质粒pcDNA3.1（＋）分别与10μL Lipo2000混合，转染细胞，于37℃、5%CO2下继续培养，于24h、36h、48h和72h分别收集细胞用于鉴定重组质粒的转染水平。

1.6 RT-PCR 采用Trizol法提取转染细胞的总RNA，经 DNaseI处 理 后，通 过 RT-PCR 检 测NS3P、NS3H和NS3基因在BHK-21细胞中的转录。PCR扩增NS3蛋白酶、解旋酶和全长基因的循环条件为：94℃2min；然后以92℃1min、55℃1 min、72℃2min进行25个循环，最后72℃延伸5 min。

1.7 间接免疫荧光 转染后24h的单层细胞用0.1mol/L、pH 7.4的PBS漂洗两次，用4%多聚甲醛固定10min后，用0.6%皂素透化10min。其后用1%BSA封闭30min。以SAB2700181（稀释度1∶500）为一抗、FITC标记的羊抗兔（1∶100稀释度）为二抗进行间接免疫荧光检测。

1.8 Western印迹 转染后48h收集细胞，用预冷的PBS缓冲液洗涤两次后，提取细胞总蛋白。将总蛋白定量后溶解于1×上样缓冲液中，煮沸5min后，离心，经12%SDS-PAGE分离；用半干转移印将胶上蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h；以1∶1 000稀释的Anti-NS3（SAB2700181）为一抗，室温孵育2.5h，用 TBST洗膜6次，每次5min；以1∶8 500稀释的HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，于室温孵育1h；用TBST洗膜6次，每次5min；ECL显色。

1.9 病毒感染和Real-time PCR反应体系 将转染6h后的细胞，弃去 转染液，用 DENV－2（MOI＝1）攻击细胞，96h后收集细胞，用Trizol试剂提取各组BHK-21细胞的RNA，具体步骤详见说明书及相关文献。提取的总RNA（1ug）经逆转录为cDNA，备用于实时荧光定量PCR（QPCR）分析。QPCR反应体系和条件按说明书进行相关操作。反应条件：预变性95℃，30s，变性95℃、5s，退火55℃、30s，延伸72℃、30s，扩增40个循环，并收集溶解曲线。BHK-21分为以下3个组：实验组：质粒pcNS3P、pcNS3H和pcNS3转染，病毒攻击；空白对照组：质粒pcDNA3.1（＋）转染，病毒攻击；阳性对照组：未转染质粒，病毒攻击。

1.10 统计学处理 使用SPSS13.0统计软件分析数据，组间比较采用One-Way ANOVA的多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 重组表达载体的构建与鉴定 以登革2型NGC株病毒全长cDNA克隆载体为模板进行扩增，可分别获得555bp、1 299bp和1 854bp的DNA片段（图2），与预期的NS3P、NS3H 和NS3基因大小一致。经同样双酶切的PCR产物与pcDNA3.1（＋）进行连接，转化大肠杆菌DH5α后经菌液PCR筛选阳性克隆。测序结果表明，插入片段序列分别与NS3P、NS3H和NS3完全一致，并以正确的读码框插入表达载体。

2.2 重组pcNS3P、pcNS3H和pcNS3蛋白的表达与鉴定 采用Lipo2000将重组载体及pcDNA3.1（＋）转染BHK-21细胞后，首先在RNA水平检测NS3P、NS3H和NS3基因的转录。为避免质粒污染，提取转染48h后的细胞总RNA后，经DNase I处理后，用蛋白酶及解旋酶的两对引物进行RTPCR。结果可获得分别与NS3H和NS3P大小一致的基因片段。未转染组及空白质粒转染组则不能获得目的条带。（图3）这说明重组质粒pcNS3P、pc-NS3H和pcNS3可在BHK-21细胞中转录产生NS3及其结构域基因的mRNA。

图2 登革2型病毒NS3P、NS3H和NS3基因的扩增M：DL2000；1：NS3P基因扩增产物；2：NS3H 基因扩增产物；3：NS3基因扩增产物Fig.2 Products of DEN-V 2-NS3P，NS3Hand NS3by PCRM：Marker DL2000；Lane 1：Product of DENV 2-NS3P；Lane 2：Product of DENV 2-NS3H；Lane 3：Product of DEN-V 2-NS3.

图3 RT-PCR检测NS3P、NS3H和NS3基因在BHK-21细胞中的转录M：DL2000；1和12：未经转染处理的总 RNA；2、4和7：转染pcNS3的细胞总RNA；3和6：转染pcNS3H的细胞总RNA；5和10：转染pcDNA3.1（＋）的细胞总 RNA；9和11：转染pcNS3P的细胞总RNAFig.3 Level of transcription of NS3P，NS3Hand NS3gene in BHK-21cells by RT-PCRM：Marker DL2000；Lane 1and 12：The transcription of total RNA without transcription；Lane 2，4 and 7：The transcription of total RNA with pcNS3 recombination plasmid；Lane 3and 6：The transcription of total RNA with pcNS3Hrecombination plasmid；Lane 5and 10：The transcription of total RNA with pcDNA3.1（＋）plasmid；Lane 9and 11：The transcription of total RNA with pcNS3Precombination plasmid.

为进一步观察登革2型NGC株非结构蛋白NS3及其结构域在BHK-21细胞中的表达情况，我们于转染24h后收集细胞，采用抗登革2型病毒NS3多克隆抗体作为一抗，进行间接免疫荧光检测。结果表明，转染24h、36h、48h和72h后，可在细胞质中观察到吸附有特异绿色荧光颗粒的物质，这说明NS3、NS3H和NS3P已在BHK-21细胞中表达（图4）。转染48h后提取细胞总蛋白进行SDS-PAGE，将胶上蛋白转移至PVDF膜，以Anti－NS3为一抗进行Western印迹，结果存在相对分子量约为69kDa、50kDa及18kDa的特异蛋白（图5），与 DENV2-NS3、DENV2-NS3H 和 DENV2－NS3P蛋白的预测大小相吻合。

图4 间接免疫荧光检测NS3P、NS3H和NS3在BHK-21细胞中的表达（瞬时转染24h，400×）A为NS3P的表达；B为NS3H的表达；C为NS3的表达；D为转染pcDNA3.1（＋）Fig.4 Immunofluorescence of BHK-21cells transfected with recombinant plasmids based on NS3functional domains（Magnification 400×）A：NS3P；B：N3P；C：NS3；D：pcDNA3.1（＋）.

2.3 Real-time PCR 探讨重组 pcNS3、pcNS3H 及pcNS3P在细胞胞内对DENV复制的抑制效果 收集经DENV-2型NGC病毒株攻击72h的各转染实验组、未转染组及空白对照组的BHK-21细胞，应用QPCR检测各组细胞内病毒载量的变化。图6显示：转染pcNS3、pcNS3H组均与空白对照组及未转染组间的病毒载量存在着差异（P＜0.05），空白对照组与未转染组之间差异没有统计学意义。转染pcNS3P组虽与未转染组及空白对照组间有量的变化，但之间的差异仍无统计学意义（P＞0.05）。

图5 Western印记检测NS3P、NS3H和NS3蛋白在BHK-21细胞中表达M：蛋白Marker；1：转染pcNS3H的细胞总蛋白；2和4：转染pcNS3的细胞总蛋白；3：转染pcDNA3.1（＋）的细胞总蛋白；5：转染pcNS3P的细胞总蛋白。箭头为所指目的蛋白条带Fig.5 Protein of NS3P，NS3Hand NS3of DEN-V II in BHK-21by Western blotM：Marker；Lane 1：Total proteins of cells with transcription；Lane 2and 4：Total proteins of cells with pcNS3；Lane 3：Total proteins of cells with pcDNA3.1 （＋）；Lane 5：Total proteins of cells with pcNS3P.

图6 实时荧光定量PCR比较分析重组蛋白对登革2型病毒的调控（抑制）水平 （＊表示差异存在统计学意义，＊＊＊，P＜0.001；＊，P＜0.05）Fig.6 Regulation for virus replication of recombination proteins of DENV-2with QPCR

3 讨 论

登革病毒非结构蛋白NS3，具有疏水性，在黄病毒中有很高的保守性［9］，具有若干个T细胞表位［10］。已有试验表明，NS3蛋白在病人和受试者体内可诱导产生较好的免疫反应。为深入了解NS3在登革病毒致病过程中的作用机制，我们首先在哺乳细胞BHK-21中表达了DENV-2-NGC病毒株的NS3蛋白及其结构域，并对其活性作了初步的探究。

NS3蛋白由N端185个氨基酸残基的蛋白酶及C端433个氨基酸残基的解旋酶两个结构域构成［11－12］。NS3蛋白 N 端前180氨基酸含有丝氨酸蛋白酶区域，其前167氨基酸是DEN-V-2蛋白水解活性所需的最少残基数［13－14］，剩余的C端含有3个酶活性的区域：NTP酶、RNA解螺旋酶和RTP酶，所以NS3蛋白对病毒在宿主体内的复制起着极其重要的作用。研究发现pcNS3及pcNS3H重组质粒可在哺乳细胞内对登革病毒的复制具有一定的抑制作用。最近研究发现日本脑炎病毒中NS3蛋白区域和NS3解螺旋酶区域会启动细胞死亡程序［15］，而日本脑炎病毒和登革病毒同属黄病毒家族，都经过蚊媒传播。另外，在Langet病毒，一种蜱传播的脑炎黄病毒家族中，其NS3蛋白也需要结合半胱天冬酶-8引起细胞凋亡［16］。所以，登革病毒的NS3蛋白和NS3H也有可能是通过启动细胞死亡程序来减少病毒在宿主体内复制。NS3蛋白N端前180氨基酸含有丝氨酸蛋白酶区域，这个区域要发挥作用，需要病毒NS2B区域的活性［17］，故而转染pcNS3P的重组质粒的BHK-21细胞对登革病毒的复制没有明显的抑制作用。

本研究缺陷在于 Western检测（图5）的NS3、NS3P和NS3H蛋白的特异性条带尚不清楚，原因为使用的是DENV-2-NS3的多克隆抗体进行检测，致使目的条带不特异，但蛋白的分子量符合大小。本实验后期在各蛋白下游加His-Tag标签蛋白，使用特异性抗体的针对His-Tag的蛋白进行检测。

综上所述，NS3蛋白区域具有一定的抗病毒作用，但这种作用主要集中在NS3H区域，而需要NS3P区域发挥抗病毒作用，可能需要NS2B区域的共同作用，这为我们进一步研究登革病毒非结构蛋白NS3基因疫苗提供一定的策略［18］。

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