硝酸镓可降解涂层的体外抗菌实验

朱元元，杨双旺，邱 彦

细菌可在各种生物和非生物的表面形成生物膜，生物膜包含蛋白质、多糖和核酸等基质。生物膜形成是一个复杂的发展过程［1-4］，生物膜在器械相关的感染发病机制中扮演重要角色。细菌生物膜的形成是院内感染的重要来源，可导致导尿管、血管内导管相关的菌血症和呼吸机相关性肺炎［5-6］。生物膜的形成使细菌避开免疫系统的攻击，因为在生物膜中的细菌有基质的保护，且细胞的代谢速度较慢，使它们能够在高于最小抑菌浓度100～1000倍的抗生素中生存下去［7-9］。而大量使用抗生素则增加了抗生素耐药性［10-11］，因此对新的抗菌药物的需求日益迫切。

在几乎所有的病原体中，铁离子(Fe3+)在DNA合成，呼吸链和关键酶的功能和氧化应激防御反应中均有重要作用，是细菌生长所必需的［12］。金属镓的离子半径几乎和铁一样，而且许多生物都无法区分镓离子(Ga3+)和Fe3+，因此Ga3+可用以破坏依赖Fe3+的生化反应。体外和体内研究表明Ga3+通过干扰Fe3+的功能，可抑制各种病原体生长［13］。

本课题组的前期研究中已制备了一种可以黏附在塑料表面的硝酸镓聚合物［14］。本研究对此材料以硝酸镓聚合物包被并对其抗菌活性进行对比分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源和培养［15］铜绿假单胞菌(ATCC27853)购自国家卫生部临床检验中心。铜绿假单胞菌在LB液体培养基(培养基由10.0 g/L的蛋白胨，5.0 g/L的酵母提取物，10.0 g/L的氯化钠组成，pH 7.0～7.2)，37℃下振荡培养24 h。收集菌种并用生理盐水稀释。

1.2 最小抑菌浓度的测定［14］37℃过夜培养的试验菌株用新鲜的胰蛋白酶大豆肉汤稀释10倍。由于吸光度和细菌密度成正比，因此采用酶标仪测其在600 nm处的吸光度(OD值)作为相对定量，并以此代表细菌的生长程度。37℃下培养试验菌株以酶标仪测其600 nm的OD值达到1.5左右，即为达到实验所需的指数生长阶段。将其加入到含不同浓度硝酸镓的孔中，无菌对照孔不加细菌，阳性对照孔不加硝酸镓。

1.3 表面涂层 0.5%的明胶水溶液高压灭菌。冷却后，将明胶溶液、硝酸镓(Sigma公司产品)和乙二胺四乙酸(EDTA)溶液混合，硝酸镓终浓度为20 μM，EDTA的终浓度为10 μM。将聚氯乙烯(polyvinyl chloride polymer，PVC)片用打孔机制备成直径6 mm的圆片，用无水乙醇、去离子水超声波振荡清洗15 min，放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15～20 min高压消毒后，放在37℃温箱2 d，使完全干燥。将薄片浸入到上述明胶-硝酸镓-EDTA混合液，取出置于超净台中自然干燥，备用。

1.4 抗生物膜持久性检测［14］将10 mL消毒的尿液置于50 mL聚苯乙烯管(Falcon公司产品)。加入薄片，37℃静置。分别在1、2、4、7 d后取出薄片，无菌过滤纸吸干，进行Kirby-Bauer法(K-B法)扩散试验。在超净台中，严格按无菌程序用接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上，再取薄片贴到LB固体培养基(每升含蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化钠10 g和琼脂15 g)表面，在平皿中央贴1片，外周等距离贴5片，使薄片与培养基紧密相贴。将平皿培养基置于37℃温箱中培养24 h后，测量抑菌圈的直径。

采用稀释法测定膜上依附的细菌数量。分别取不做处理的PVC片和经过涂层处理的PVC片各6片，置于含20 mL铜绿假单胞菌LB培养液，37℃恒温培养7 d。取经培养的PVC片置于5 mL生理盐水震荡30 min，倒出生理盐水，再加1 mL生理盐水震荡15 min后取出薄片，合并生理盐水以10倍梯度连续稀释至10 000倍，各梯度样本分别以0.1 mL量加入无菌LB固体培养基培养皿中涂布培养，置37℃培养18 h，观察菌落生长情况，作菌落计数。按以下公式计算出细菌数:细菌数=菌落数×稀释倍数×10。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行数理统计，实验所得计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间均数间的两两比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 最小抑菌浓度(MIC)的测定 在96孔板中将细菌接种于含硝酸镓5～30 μM的培养液中。37℃培养24 h后测定600 nm的OD值。结果显示，硝酸镓剂量依赖性地抑制细菌生长，MIC约为20 μM。

图1 硝酸镓对铜绿假单胞菌的抑制作用

2.2 对生物膜的抑制作用 将PVC片在尿液中浸泡1～7 d后，测定PVC片的抑菌作用。7 d后K-B扩散试验显示，抑菌圈均保持在20.0mm以上［第0、1、2、4、7 天抑菌圈直径分别为(22.1 ±1.3)mm、(22.3 ±1.2)mm、(21.8 ±0.9)mm、(21.1 ±0.7)mm、(20.1 ±1.7)mm］，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，抑菌效果较为稳定。

为了进一步评价硝酸镓涂膜抑制细菌生物膜形成的能力，分别将经硝酸镓处理过的和未处理过的PVC片放到铜绿假单胞菌的细胞悬液中，并在37℃条件下培养24 h，无需振荡，再采用稀释法分别测定膜上依附的细菌数量。结果显示，未处理的PVC片上每片的平均细菌数为(2.29±0.13)×107个，而处理过的为(3.33±0.92)×103个，差异有统计学意义(P ＜0.01)。

3 讨论

越来越多的临床治疗需要使用植入式器械。这些器械，不论是作为短期使用还是植入体内终身使用，均可因为细菌生物膜的形成导致严重的全身感染。这在整形外科中极为常见，细菌生物膜的形成会导致严重的并发症，包括义肢感染等，致死亡率和医疗费用的增加［16-17］。本文研究了常用作医疗植入材料的PVC上的硝酸镓涂层对生物膜形成的影响。

生物膜的形成是个复杂的发展过程，包括细菌黏附和表面固定形成菌落，并融合生物膜［1-4］。生物膜的消除亦非常困难，固定在生物膜中的细菌比游离状态的细菌更耐抗生素。已经证明用Ga3+取代Fe3+可以干扰细菌DNA和蛋白质的合成，抑制细菌生物膜的形成。Ga3+已被FDA批准治疗恶性高钙血症，具有很好的安全性，本文硝酸镓终浓度为20 μM。明胶是以动物的皮、骨为原料制成的蛋白分子聚合物质。明胶分子结构上有大量的羟基、羧基和氨基，使得明胶具有极强的亲水性，又因其具有无毒、生物相容性好并在生物体中可完全降解等优点，故选用明胶作为溶解基质。结果表明，涂布EDTA-镓-明胶的PVC具有较好的抗菌作用。将EDTA-镓-明胶涂覆在PVC表面，在防止医疗器械感染上的用途值得进一步研究。

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