泰勒焦虫表面抗原TaSP、spag-1和Tams1基因片段克隆与序列分析

郭会玲，易 忠，艾尼瓦尔·台外库力，陶兴洋，斯马依·伊斯拉木，达力夏·孜乃提，包拉提，王 延，薛 英，魏玉荣*,黄 炯*

（1.新疆新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆喀什地区动物疾病控制与诊断中心，新疆 喀什 844000；3.新疆克拉玛依绿成农业开发有限责任公司，新疆 克拉玛依 834000；4.新疆塔什库尔干县畜牧兽医站，新疆 塔什库尔干 845250；5.新疆塔什库尔干县达布达尔乡畜牧兽医站，新疆 塔什库尔干 845250；6.新疆昭苏县畜牧兽医站，新疆 昭苏 835600）

泰勒焦虫表面抗原TaSP、spag-1和Tams1基因片段克隆与序列分析

郭会玲1，易 忠1，艾尼瓦尔·台外库力2，陶兴洋3，斯马依·伊斯拉木4，达力夏·孜乃提5，包拉提6，王 延1，薛 英1，魏玉荣1*,黄 炯1*

（1.新疆新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆喀什地区动物疾病控制与诊断中心，新疆 喀什 844000；3.新疆克拉玛依绿成农业开发有限责任公司，新疆 克拉玛依 834000；4.新疆塔什库尔干县畜牧兽医站，新疆 塔什库尔干 845250；5.新疆塔什库尔干县达布达尔乡畜牧兽医站，新疆 塔什库尔干 845250；6.新疆昭苏县畜牧兽医站，新疆 昭苏 835600）

为了解泰勒焦虫表面抗原基因特性，利用PCR方法对实验室保存的泰勒焦虫细胞表面抗原spag-1、Tams1和TaS部分基因片段进行克隆与序列分析。PCR结果显示所扩增的spag-1、Tams1和TaSP部分基因长度分别为372bp，324bp和321bp。系统发育树分析表明，与本次测序表面抗原TaSP和Tams1基因片段同源性最高的虫株登录号分别为FJ895154和AF214797的泰勒焦虫株，同源性分别高达100%与99.69%；与spag-1基因片段同源性最高的虫株登录号为X78188、XM949884和M63017，它们之间同源性为100%。

泰勒焦虫；TaSP；spag-1；Tams1；克隆；序列分析

泰勒焦虫病是蜱传性血液原虫病。泰勒焦虫（Thei1eria annu1ata，T.annu1ata）表面抗原有子孢子表面抗原 （The sporozoite antigen，spag-1）、裂殖子/梨浆虫表面抗原 （The merozoite/pirop1asm surface antigen, Tams1）和裂殖体表面抗原（Thei1eria annu1ata surface protein，TaSP）等。Spag-1是病原入侵和被宿主细胞识别所必须的，可溶性的spag-1作为ELISA抗原检测T.annu1ata感染抗体非常有效[1]。Tams1是虫体感染红细胞时表面分泌的一种膜蛋白，具有较好的免疫原性，同样存在抗原多样性[2]。TaSP是一种免疫分子，感染宿主可以通过主要组织相容复合物(major histocompatibi1ity comp1ex，MHC)的递呈产生抗TaSP的抗体[3]。TaSP、spag-1和Tams1在焦虫--机体免疫中起到重要作用，其蛋白内部的高免疫原性区有可能成为研制亚单位疫苗的重要靶点。了解泰勒焦虫表面抗原SPAG1、Tams1和TaSP基因特性可为其亚单位疫苗或诊断试剂的制备奠定基础。

1 材料和方法

1.1 样品及主要试剂

DH5a宿主菌由本室保存，pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司，P1asmid Minipreps Kit、Wizard Genomic DNA Purification Kit、Ge1 Extraction Kit均购自Promega公司。

1.2 焦虫基因组提取

悬浮培养泰勒焦虫细胞液3 mL，12 500 r/min离心30 s，加入300 μL PBS悬浮。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit，参照试剂说明提取焦虫基因组，4℃保存备用。

1.3 引物设计与PCR扩增

根据GenBank登录的泰勒焦虫spag-1、Tams1、TaSP及全基因组序列，应用软件O1igo6.24进行引物设计，由北京捷瑞生物公司合成（表1）。以焦虫基因组为模板进行PCR。

表1 扩增Tams1、SPAG1、TaSP基因的引物

Tams1、spag-1及TaSP基因部分片段的扩增：以提取的焦虫基因组为模板，分别以Tams1 F/R、SPAG1 F/R及TaSP F/R为引物通过PCR扩增目的基因Tams1、spag-1及TaSP。反应体系如0.2 mL PCR管中加入：10×Pfu DNA po1ymerase缓冲液5 μL，10 mM dNTP 2 μL，MgC12（2.5 mM）2 μL，上下游引物(20 pmo1)各1 μL，Pfu DNA po1ymerase(5U)0.5 μL，加入ddH2O使反应总体积至50 μL。反应参数为：94℃5 min；94℃45 s，50℃35 min，72℃45 s，30个循环后，72℃保温10 min。 PCR扩增结束后，取产物8 μL经琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确的目的条带切胶回收，分别命名为基因Tams1、spag-1和TaSP。

1.4 PCR产物的克隆及序列测定

PCR产物回收与提取质粒酶切鉴定、筛选阳性克隆、pMD18-T载体连接，均按试剂盒说明操作。连接产物转化感受态细胞DH5a。挑取经鉴定含相应基因片段的各克隆送上海生工生物技术有限公司进行测序。测序正确的克隆分别命名为pMD-TaSP、pMD-spag-1和pMD-Tams1。

TaSP、spag-1和Tams1基因的序列分析 运用DNAMAN及DNAStar软件对测序结果进行分析，并与Genbank中相关序列进行同源性比对，运用MEGA5.0软件绘制系统发生树。

2 结 果

2.1 泰勒焦虫表面抗原TaSP、spag-1及Tams1基因片段的PCR扩增结果

分别使用TaSP、spag-1和Tams1基因特异性引物进行PCR扩增，产物的电泳结果显示TaSP、spag-1 和Tams1基因片段扩增大小分别是372bp，324bp，321bp，与预期条带大小一致（见图1）。

图1 TaSP、spag-1及Tams1基因片段PCR产物

2.2 TaSP、spag-1及Tams1基因片段序列测定结果与系统发育树的建立

经上海生工生物工程技术服务公司测序后，所得TaSP、spag-1和Tams1片段序列（）与Genbank中相关序列进行同源性比对，运用MEGA5.0软件绘制系统发育树（见图2、3、4）。

TaSP基因片段：gaagatcaacagcctttggaccctaatcaacttataga tcaagctgaacaatctcaagaacctatt caacctactgatgaatctccacagg aacaggaacagatagaaactcaagaatctgaagagttagagccagaaactgttacagtagaagttccagaacccgttacatcagaagaatctaaggaatctactcaa actgaacaaaaaccagaacaacctgaaccagttgatgaacctccagttcaacctactgaatctactcctactaaggcaagttctagtggtgatggagcagcccctt gtcatgggaaacaccatgatgatgactctgacgggaaagaatctaaatcc

spag-1基因片段：gaagttttgaaagttctggatgaactagtgaaggatgtaagcgaagaacatgttggaatagg agatt taagtgacccaagtagcagaac accaaatgcaaaaccagccgaact tggaccttcactagtgatacaaaatgta ccgtcagacccctcaaaagtgacaccaacacagccttcaaatttgccacaag taccaacaacagggccggggaacggg acggatggaacaacaacaggaccaggtggaaacggggaaggaggcaaagatttgaaggaaggagaaaagaaagaa ggattatttcaaaagatcaaaaacaaactc

TamsI基因片段：ttcaaaccttccaaagttctcttcgaaaagaaagaagtcggaaaaccaaacaatgccaagta tcttgatgttttcgtctttgtcagtgctgat tccaagaaggtcgtcagactcgactacttctataccggtgactcaaggttaaaggagacctacttcgagcttaaggacgataagtgggttcaaatgtcacaggcagatg caaacaaggccttgaacgccatggactcatcatggtcatccgattacaaaccagttgtcgacaagttctctccccttgcagtcttcgcctcagtactcatcgtcttctc atcagtcctt

将测序获得的基因序列 （以Thei1eria annu1ata XJ标注）与Genbank数据库中其他泰勒焦虫进行比较。比对所用序列的登录号见表2。

表2 本文所用到的Genbank数据库中的泰勒焦虫序列

从图2可见本次测序获得Tasp基因序列与Genbank登录号为FJ895154的泰勒焦虫株在同一进化分支，且序列同源性最高达100%，由此可以推测二者来源相同或属于同一虫株。从进化树可见，本文比对的8条序列明显聚类为两大分支：中国新疆泰勒焦虫虫株与苏丹虫株（登录号为EU032559、EU032559），它们的亲缘关系更近，同源性达90%；中国宁夏、内蒙古及中国某地虫株处在另一进化分支，同源性为95.5%，该进化分支与本次测序序列同源性约为85%。

图2 基于Tasp基因的进化树分析

从图3可见，基于Tams1基因与Genbank其它泰勒焦虫做遗传进化分析也具有明显的两大进化分支。本次测序获得Tams1基因与来自印度（登录号AF21 4840）和苏丹（登录号AF214797）的虫株亲缘关系最近，同源性分别为99.38%和99.69%。中国甘肃株与突尼斯虫株亲缘关系较近，它们之间的同源性高达98.34%。测序的新疆株与甘肃株间的同源性为96.57%。

图3 基于Tams1基因的进化树分析

从图4可以看出，基于spag-1基因所建立的进化树聚类为两大分支。本次测序获得spag-1基因序列与土耳其（登录号X78188、XM949884）及印度（登录号M63017）虫株亲缘关系最近，它们之间同源性为100%，可见其来源相同或属于同一虫株。本次测序基因spag-1与苏丹虫株序列（登录号AF128526）同源性为77.78%，亲缘关系较远。

图4 基于spag-1基因的进化树分析

3 讨 论

近年来，T.annu1ata流行区域在逐渐扩大。简子健等人利用间接ELISA血清学诊断方法，对2006-2008年期间新疆14地州市监测点牛群进行T.annu1ata流行病学调查，发现新疆T.annu1ata感染的特点是疫区分布广，感染率在11%以上，且有上升趋势[4]。巴音查汗等人的调查表明新疆牛泰勒焦虫病发病率和死亡率可达40%或更高[5]。鉴于T.annu1ata对养殖业的危害，笔者从分子生物学方面对T.annu1ata基因组片段进行了扩增并进行了遗传进化分析。

本试验对所保存的新疆泰勒焦虫株表面抗原TaSP、spag-1和Tams1基因片段进行了克隆，并对序列进行分析。结果表明：扩增的新疆株泰勒焦虫TaS基因序列与登录号FJ895154中国新疆株亲缘关系最近达100%，可能为同一起源或同一虫株，同时该虫株与苏丹（登录号为EU032559、EU032559）虫株同源性也很高；Tams1基因序列与苏丹（登录号AF214797）及印度（登录号AF214840）虫株同源性高达99%以上；spag-1基因序列与土耳其 （登录号X78188、XM949884）及印度 （登录号M63017）虫株同源性高达100%，但与苏丹（登录号AF128526）同源性较低。由于寄生虫基因组庞大，Genbank中泰勒焦虫全基因组序列信息非常有限，本次只是表面抗原基因片段测序，还不能推测所测序虫株的准确起源。

综上所述，本次对泰勒焦虫表面抗原SPAG1、Tams1和TaSP基因片段进行克隆及测序，旨在了解测序虫株的基因特性，为其亚单位疫苗或诊断试剂的制备奠定基础。

[1]katzer F.,Carrington M.,Knight P.,et a1.Po1ymorphism of SPAG-1,a candidate antigen for inc1usion in a subunit vaccine against Thei1eria annu1ata[J].Mo1 Biochem parasito1,1994,（67）:1-10．

[2]Knighta,P.,Musokeb,A.J.,Gachanjab,J.N.,et a1.Conservation of neutra1izing determinants between thesporozoite surface Antigens of Thei1eria annu1ata and Thei1eria parva[J].Exp Parasito1,1996,82(3):229-241.

[3]Seitzer,U.,Bakheit,M..A.,Sa1ih,D.A.,et a1.From mo1ecu1e to diagnostic too1:Thei1eria annu1ata surface proteinTaSP[J].Parasito1 Res,2007,101(Supp1 2):S217-S223.

[4]简子健,马素贞,孙其喆,等.新疆牛环形泰勒虫虫病的流行病学调查[J].新疆农业科学,2011,48(8):1509-1513.

[5]曹雯丽,陈亮,刘启生,巴音查汗.新疆牛环形泰勒虫病的流行现状和防治[J].草食家畜，2011,152(3):76-78.

Cloning and Sequence Analysis of TaSP,Spag-1 and Tams1 Gene Fragments of Theileria Annulata Surface Antigen

GUO Hui-1ing1,YI Zhong1,AINIWAERO·Taiwaiku1i2,TAO Xing-yang3，SIMAYIO·Yisi1amu4, DALIXIAO·Zimaiti5,BAO La-ti6,WANG Yan1,XUE Yin1,WEI Yu-rong1*,HUANG Jiong1*
（1.Institute of Veterinary Medicine,Xinjiang Academy ofAnima1 Sciences,Urumqi 830000,China；2.Contro1 and Diagnosis Center of the Anima1 Disease from Kashgar Region,Kashgar 844000,China；3.Ka1amayi Lucheng Agricu1tura1 Exp1oiture Co,.LTD,Ka1amayi 8340000，China；4.Tashkurgan Anima1 Husbandry and Veterinary Station in Xinjiang,Tashkurgan Xinjiang 845250，China; 5.Dabudar country Anima1 Husbandry and Veterinary Station in Tashkurgan, Tashkurgan Xinjiang 845250，China; 6.Zhaosu Anima1 Husbandry and Veterinary Station in Yi1i Region,Zhaosu Xinjiang 835600,China）

To study the genes characteristics of Thei1eria annu1ata surface antigen,gene fragments of spag-1 and Tams1 and Tasp were c1oned by PCR and sequenced.The resu1t showed that PCR products of genes fragment of TaSP,spag-1 and Tams1 were 372bp,324bp and 321bp,respective1y.After sequenced,phy1ogenetic tree was drew using genes fragment TaSP,Tams1 and spag-1.The ana1ysis of Phy1ogenetic tree revea1ed that he highest homo1ogy is 100%with the stain of accession number FJ895154 based on Tasp gene sequences of Thei1eria annu1ata,and it has a high homo1ogy with the stain of accession number AF214797 of 99.69%based on Tasp gene sequences of Thei1eria annu1ata.The sequence of spag-1 genes fragment is most simi1ar to the stain of accession number X78188,XM949884 and M63017 with 100%,respective1y.

thei1eria annu1ata；TaSP；spag-1；Tams1；c1one；sequence ana1ysis

S855.9

：A

：1003－6377（2014）02－0055-05

2014-01-11

国家自然科学基金项目（31160505）,十二五"国家科技支撑计划（2013BAD2B04）

郭会玲（1973-），女，兽医师，硕士，主要从事动物传染病研究。

魏玉荣（1978-），女，高级实验师，主要从事动物传染病研究。

黄炯（1963-），男，研究员，博士生导师，主要从事动物传染病研究与生物制品研发。