辛伐他汀对胶原诱导关节炎大鼠的治疗机制探索*

王友莲 杨明峰 尚 可 皮 慧

辛伐他汀对胶原诱导关节炎大鼠的治疗机制探索*

王友莲1杨明峰2尚 可1皮 慧2

目的 以胶原诱导关节炎（CIA）大鼠为模型，观察辛伐他汀对其血清细胞因子及滑膜组织天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）表达的影响，探索辛伐他汀治疗类风湿关节炎的可能机制。方法使用牛Ⅱ型胶原建立CIA模型，将造模成功的大鼠（16只）均分为模型组及药物组，未造模者（7只）为对照组。药物组用2.0 mg/（kg·d）灌胃，对照组和模型组用无菌注射用水5 mL/（kg·d）灌胃。记录大鼠关节炎评分（AI）和足趾容积，每周1次；初次免疫后第42天，眼内眦取血采用ELISA法检测各组血清肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6水平，处死大鼠取后肢踝关节进行HE染色，并用免疫组织化学检测滑膜组织Caspase-3表达。结果药物组和模型组AI在初次免疫后21 d开始下降，35 d后药物组均低于模型组（均P＜0.05）。2组足趾容积于初次免疫14 d后缓慢下降，但仍明显高于对照组；35、42 d时药物组均低于模型组（均P＜0.05）。初次免疫后42 d，药物组TNF-α和IL-6水平均低于模型组，高于对照组（均P＜0.05）。药物组较模型组踝关节滑膜组织增生明显减轻，仅有少量炎细胞浸润，Caspase-3的表达明显上调。结论辛伐他汀可明显抑制CIA大鼠血清TNF-α、IL-6的分泌，上调滑膜组织Caspase-3的表达及减轻滑膜组织增生。

辛伐他汀；关节炎,类风湿；白细胞介素6；肿瘤坏死因子α；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种自身免疫性炎症疾病，主要表现为慢性、对称性、破坏性多关节炎及系统损伤。辛伐他汀是一种HMGCoA还原酶抑制剂，具有较强的降血脂作用。近年来大量研究发现辛伐他汀同时具有抗炎及免疫调节作用，且这些作用与其传统的降脂作用无关[1]。本研究以胶原诱导关节炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠为模型，观察辛伐他汀对CIA的治疗效果，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠30只，SPF级，雌性，体质量140～160 g，购自长沙市开福区东创实验动物科技服务部[许可证号：SCXKS（湘）2009-0012]，于实验开始前适应性喂养7 d，动物标准住宿条件：光照、黑暗各12 h，湿度55%～60%，室温（22±2）℃。

1.2 主要仪器和试剂 白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（美国raybiotech公司）。牛Ⅱ型胶原（C7806）、弗氏完全佐剂（卡介苗含量1 g/L，美国sigma公司）。兔抗鼠含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3（anbo公司）。二步法免疫组化试剂盒及DAB显色液（中杉金桥公司）。

1.3 动物免疫 牛Ⅱ型胶原20 mg溶于10 mL 0.1 mol/L的醋酸溶液中，4℃过夜备用。取等剂量胶原溶液及弗氏完全佐剂，在冰上，用玻璃注射器中间连接三通阀，互推1 h，可完全乳化，乳剂中胶原浓度为1 g/L。随机取23只大鼠，每只大鼠尾根部及背部3点皮内注射共0.35 mL乳化液，10 d后采用相同方法免疫，剂量为0.2 mL。另外7只大鼠采用相同方法注射生理盐水。

1.4 分组及给药 于初次免疫后第14天采用5级评分法对大鼠关节炎指数（AI）进行评分，每周1次，评分标准为：0分，无红肿；1分，小趾关节轻度红肿；2分，小趾关节和足跖肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，包括踝关节在内的全部足爪、关节肿胀，共16分。将得分≥6分的16只大鼠均分为模型组及药物组，7只未进行造模者为对照组，并将造模失败者（7只）处死。药物组给予辛伐他汀按2.0 mg/(kg·d)灌胃，对照组及模型组给予无菌注射用水5 mL/(kg·d)灌胃。药物组、模型组均有1只大鼠分别在给药第16、21天时出现意外死亡。

1.5 足趾容积测定 使用自制足趾容积测量器，每周测量1次踝关节以下全足容积，每只大鼠测量3次取平均值。

1.6 TNF-α和IL-6测定 初次免疫后42 d，眼内眦静脉取得血标本，于室温下放置1 h，离心（1 800 r/min，10 min），分离血清，严格按照ELISA试剂盒说明书步骤检测各组大鼠血清TNF-α和IL-6水平。

1.7 踝关节HE染色及Caspase-3检测 初次免疫后42 d处死大鼠，取各大鼠后肢踝关节迅速置于10%中性甲醛中固定7 d，置于10%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙液中35 d，用针灸针检测脱钙完全后，流水冲洗2 h，纵向切开，常规脱水，石蜡包埋，4 μm切片后行HE染色或微波修复，严格按照说明书步骤检测踝关节滑膜组织Caspase-3的表达，一抗采取1∶80稀释及4℃过夜孵育，DAB显色后苏木素复染，脱水，透明，封片。

1.8 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计处理，计量资料以±s表示，2组间比较采用独立样本t检验。多组间比较方差齐者采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验；方差不齐者采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物组和模型组大鼠一般情况及体质量变化 药物组大鼠于造模后11 d开始出现一侧或双侧后肢轻度红肿，食欲不振，活动减少。14 d双侧后肢严重红肿且不能负重。自起始时至初次免疫后14 d各组大鼠体质量基本相同（P＞0.05），14 d后模型组和药物组体质量增长缓慢，35 d后药物组体质量明显高于模型组（35、42 d时F值分别为4.083、7.918，均P＜0.05），见图1。

Figure 1 Changes of body weights in different time groups of rats图1 不同时间各组大鼠体质量的变化

2.2 辛伐他汀对CIA大鼠AI的影响 药物组和模型组大鼠AI在初次免疫后21 d开始下降，35 d后药物组AI均低于模型组（35、42 d时t值分别为2.717、3.536，均P＜0.05），见图2。

Figure 2 Changes of arthritis index in different time groups of rats图2 不同时间药物组和模型组大鼠AI的变化

2.3 辛伐他汀对CIA大鼠足趾容积的影响 药物组和模型组大鼠足趾容积在初次免疫后7 d开始显著增加，14 d后开始缓慢下降；14 d后2组大鼠足趾容积均明显高于对照组（14、21、28、35及42 d时，F值分别为120.438、147.209、195.741、218.846及113.850，均P＜0.05）。初次免疫后35、42 d，药物组大鼠足趾容积均明显低于模型组（均P＜0.05），见图3。

Figure 3 Changes of hind paw volume in different time groups of rats图3 不同时间各组大鼠足趾容积的变化

2.4 辛伐他汀对CIA大鼠TNF-α和IL-6的影响 初次免疫后42 d，药物组TNF-α和IL-6水平均低于模型组，高于对照组（均P＜0.05），见图4。

Figure 4 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-6 at 42 days after the initial immunization between different groups of rats图4 初次免疫后42 d时各组大鼠血清TNF-α、IL-6的比较

2.5 辛伐他汀对CIA大鼠踝关节病理的影响 对照组大鼠踝关节腔滑膜组织结构清楚，无增生，滑膜内无炎细胞浸润；药物组大鼠关节腔滑膜组织稍有增生，且仅有少量炎细胞浸润；模型组大鼠关节腔滑膜组织明显增生，大量炎细胞浸润，见图5。

2.6 辛伐他汀对CIA大鼠踝关节Caspase-3表达的影响 对照组和模型组大鼠关节腔滑膜组织仅有极少量表达Caspase-3的阳性细胞，药物组大鼠关节腔滑膜组织Caspase-3的表达明显增多，见图6。

3 讨论

近年来有研究发现，他汀类药物可通过抑制MHCⅡ的反式激活因子进而抑制干扰素（IFN）-γ诱导的巨噬细胞MHCⅡ的表达，通过抑制Rho通路激活过氧化物酶体增生物激活受体-α。此外，其可通过识别β2整合素上的相应位点，进而使淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）与细胞间黏附分子-1（ICAM-1）之间相互作用，诱导T细胞的聚集，这些属性表明他汀类药物可能可以调节T淋巴细胞的成熟，进而发挥其抗炎及免疫调节作用[1]。国内外研究已证明他汀类药物在各种炎症动物模型及炎性疾病方面具有良好的抗炎作用[2-3]，但其确切的抗炎机制尚未完全阐明。

RA的病理特点主要表现为滑膜组织中大量的炎性细胞浸润及由此导致的滑膜增生、血管翳形成及骨质破坏。本研究结果显示CIA大鼠TNF-α、IL-6水平明显升高，提示TNF-α、IL-6在大鼠关节炎的发病中具有重要的作用，而在辛伐他汀治疗后TNF-α、IL-6、AI评分及足趾容积均明显降低，同时踝关节的HE染色也显示辛伐他汀治疗后CIA大鼠滑膜组织增生及炎症细胞浸润明显减轻，提示辛伐他汀可通过抑制CIA大鼠TNF-α、IL-6的分泌进而发挥其抗炎作用，使CIA大鼠的AI评分及足趾容积明显下降并使踝关节滑膜组织病变明显减轻。这与以往在他汀类药物（辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀）治疗关节炎方面的研究结果一致，这些研究发现他汀类药物可通过抑制滑膜细胞RhoA信号通路活性及抑制Th1相关的体液和细胞免疫反应进而发挥其抗炎作用[4-6]。此外，本研究通过免疫组化进一步发现了辛伐他汀治疗后滑膜组织凋亡蛋白Caspase-3的表达明显上调，提示辛伐他汀治疗后CIA大鼠滑膜组织增生明显减轻可能与炎症细胞浸润改善后，凋亡蛋白Caspase-3的表达上调促使滑膜细胞凋亡增加有关，与以往的细胞实验研究结果一致[7-8]。

综上所述，辛伐他汀可有效降低CIA大鼠血清TNF-α、IL-6的水平，上调滑膜组织Caspase-3的表达及抑制滑膜组织增生，从而发挥其治疗作用。辛伐他汀将可能会成为一种新的RA治疗药物，为临床治疗RA提供更多的选择。

Figure 5 Comparison of the pathological changes of ankle joint between different groups of rats(HE,×400)图5 各组大鼠踝关节病理比较（HE,×400）

Figure 6 Comparison of the Caspase-3 expression in ankle joint between different groups of rats(PV,×400)图6 各组大鼠踝关节Caspase-3表达的比较（PV,×400）

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（2013-06-30收稿 2013-08-28修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Therapeutic Mechanism of Simvastatin on Collagen Induced Arthritis in Rats

WANG Youlian1,YANG Mingfeng2,SHANG Ke1,PI Hui2
1 Department of Rheumatology and Immunology,the People’s Hospital in Jiangxi Province,Nanchang 330006,China; 2 Medical College of Nanchang University

Objective To evaluate therapeutic effects of simvastatin on serum expressions of cytokines and synovial tissue aspartic protease-3(Caspase-3)in collagen induced arthritis(CIA)in rats,and the mechanism thereof.MethodsThe rat model of CIA was established by injecting bovineⅡ collagen.Sixteen model rats were randomly divided into two groups:CIA model group(sterile water 5 mL·kg-1·d-1by gavage)and simvastatin group(2.0 mg·kg-1·d-1by gavage).Seven normal rats were included in control group(sterile water 5 mL·kg-1·d-1by gavage).The arthritis index(AI)and hind paw volumes were recorded once a week.The serum levels of cytokine,tumor necrosis factor(TNF)-α and interleukin(IL)-6 were measured by ELISA 42 days after the initial immunization.The expression of Caspase-3 in ankle synovial tissue was detected by immunohistochemical method,and pathological results of HE staining in rat ankle were compared between three groups.ResultsValues of AI were decreased on the 24-d of the initial immunization in simvastatin group and CIA model group,which was significantly decreased on the 35-d of the initial immunization in simvastatin group than that of CIA model group(P＜0.05).The values of hind paw volumes were decreased on the 14-d of the initial immunization in simvastatin group and CIA model group,which was still significantly higher than those of control group(P＜0.05).The values of hind paw volumes were decreased on the 35-d and 42-d of the initial immunization in simvastatin group than those of CIA model group(P＜0.05).The serum levels of TNF-α and IL-6 on the 42-d of the initial immunization were significantly lower in simvastatin group than those of CIA model group,but which were significantly higher than those of control group(P＜0.05). There were more synovial hyperplasia in simvastatin group than those of CIA model group.Only a small amount of inflammatory cell infiltration was found in simvastatin group.The expression of Caspase-3 was significantly higher in simvastatin group than that of CIA model group.ConclusionSimvastatin can significantly inhibit the serum levels of TNF-α and IL-6 in CIA model rats,and can up-regulate the expression of Caspase-3 in ankle of model rats.

simvastatin;arthritis,rheumatoid;interleukin-6;tumor necrosis factor-alpha;caspase 3

R593

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.018

*江西省科技厅支撑计划资助项目（项目编号：20112BBG70040）

1江西省人民医院风湿免疫科（邮编330006）；2南昌大学医学院