四妙勇安汤合生脉饮对缺氧乳鼠心肌细胞活性及天冬氨酸氨基转移酶的影响※

孟云辉 于慧卿 王 强 李武卫 刘晓燕

(河北省石家庄市中医院心内科，河北 石家庄 050051)

四妙勇安汤合生脉饮对缺氧乳鼠心肌细胞活性及天冬氨酸氨基转移酶的影响※

孟云辉 于慧卿 王 强 李武卫 刘晓燕

(河北省石家庄市中医院心内科，河北 石家庄 050051)

目的 观察四妙勇安汤合生脉饮对缺氧乳鼠心肌细胞活性及天冬氨酸氨基转移酶(AST)的影响。方法 应用醇沉技术制备四妙勇安汤合生脉饮药液，采用胰蛋白酶和胶原酶联合消化的方法分离SD乳鼠心肌细胞，采取2次差速贴壁法对心肌细胞进行纯化，原代培养。利用高纯氮气建立心肌细胞缺氧/复氧模型。原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为3组，即正常对照组、模型组及药物干预组。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测心肌细胞活性，采用全自动生化分析仪检测心肌细胞培养液AST的含量。结果 药物干预组能提高乳鼠心肌细胞OD值，降低AST含量，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 四妙勇安汤合生脉饮可能提高缺氧/复氧损伤后心肌细胞的活性，降低AST含量，从而对心肌细胞具有保护作用。

四妙勇安汤;生脉饮;心肌疾病;肌细胞，心脏;模型，动物;动物实验

近年来实验研究显示，四妙勇安汤具有抗动脉粥样硬化、保护血管新生的作用［1］。部分临床试验表明，四妙勇安汤加味对冠心病及急性心肌梗死患者疗效确切［2］。生脉饮临床主要用于冠心病心肌梗死、心力衰竭及各种休克的治疗。四妙勇安汤合生脉饮是否能够起到保护心肌细胞的作用很少报道，本研究通过实验观察四妙勇安汤合生脉饮对缺氧乳鼠心肌细胞活性及天冬氨酸氨基转移酶(AST)的影响，以为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD乳鼠20只，出生24 h以内，SPF级，雌雄不限，购自河北医科大学实验动物中心，动物合格证号:1308037。

1.1.2 药材及试剂 四妙勇安汤合生脉饮药物组成:金银花 30 g，玄参 30 g，当归 15 g，甘草 6 g，人参 9 g，麦门冬9 g，五味子6 g。中药材由河北省石家庄市中医院中药房提供。胰蛋白酶(美国Sigma公司)，Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)，AST试剂盒(上海丰汇医用仪器有限公司)。

1.1.3 主要仪器 311型CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)，全自动生化分析仪(日本东芝)，酶标仪(奥地利TECAN公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液制备 按上方准确称取每味中药，加入13倍的去离子水2 925 mL(即1 g生药加13 mL去离子水)，浸泡30 min后，急火煎煮1.5 h，16层纱布过滤，滤出药渣，隔水浓缩至生药浓度为2.65 g/mL的药液，此时(60℃)药液相对密度为1.21 g/mL。冷却后加无水乙醇，使含醇量达75%，充分搅拌，4℃沉淀24 h，滤取上清，水浴浓缩成稠膏。检测pH值7.1～7.2，密封，4℃保存备用。使用时加培养液稀释成生药浓度为133 μg/mL的使用液，细菌过滤器过滤后使用。

1.2.2 SD乳鼠原代培养心肌细胞方法及鉴定 用75%酒精消毒SD乳鼠皮肤，组织剪剖开胸部，换组织镊取下心脏，置入盛有预冷的D-hanks液的培养皿中，换组织剪与组织镊，轻轻洗去心脏上的血细胞，剪取心尖部，再用预冷的D-hanks液漂洗2～3次，洗净残血直至组织块变白，置入青霉素小瓶中，剪成大小约1 mm3小块。用0.08%胰蛋白酶与0.1%Ⅱ型胶原酶(等量混匀)消化，经200目筛网过滤去除未消化的组织及细胞团后，离心沉淀收集细胞，选择700～1 000 r/min，离心5 min，所获细胞沉淀用完全培养基悬浮;再经200目筛网过滤，再离心1次，加适量完全培养基重新悬浮细胞，移入培养瓶中，放入37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

1.2.3 分组及给药方法 将原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为3组。正常对照组:不进行缺氧/复氧处理，也不加四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液进行干预;模型组:进行缺氧/复氧处理，但不加四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液干预;药物干预组:进行缺氧/复氧处理，同时进行四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液干预。实验开始时正常对照组更换完全培养基入培养箱培养6 h;模型组及药物干预组更换无糖无血清培养液，缺氧培养4 h，随后模型组更换完全培养基，药物干预组更换含有10%四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液的完全培养基，复氧2 h，根据不同实验目的用于实验。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测心肌细胞活性

将心肌细胞接种于96板中，每孔200 μL，细胞密度3×105/mL。参照1.2.3项分组分别建立96孔板中缺氧模型并进行实验分组。每组均设8个复孔。将MTT溶液配成终浓度为0.5 mg/mL的使用液。缺氧/复氧结束后，弃去96孔板中的培养液，用D-hanks液轻轻地冲洗2次，每孔加入MTT溶液100 μL，37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h。取出培养板弃去原MTT溶液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL溶解沉淀，微量振荡器振荡15～20 min。在酶标仪上采用波长490 nm检测各孔光密度值(OD)。同时设空白对照孔，作为空白孔调零，不加细胞只加培养液，其他实验步骤相同。

1.3.2 心肌细胞培养液中AST含量检测 在缺氧/复氧实验结束后，留取正常对照组、模型组及药物干预组各组心肌细胞培养液3 mL，4℃贮存，留取样本6份。样本室温放置 30 min后 1 000 r/min，离心 5 min，取上清液0.2 mL，按AST试剂盒操作说明加入试剂一［100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.26 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)溶液、3.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、3.0 kU/L 乳酸脱氢酶］2 mL，再加入试剂二［100 mmol/L Tris、240 mmol/L L- 天冬氨酸、12 mmol/L α-酮戊二酸、1.0 kU/L氢氧化镁(MDH)2 mL］，混匀后置37℃孵育60～300 s，然后上全自动生化分析仪检测心肌细胞培养液中AST的含量。分别于60、120 s时读取吸光度值，使用蒸馏水在340 nm处调零。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差(¯x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组乳鼠心肌细胞活性比较 见表1。

由表1可见，与正常对照组比较，模型组OD值明显降低(P＜0.05)，心肌细胞数量减少;与模型组比较，药物干预组OD值增高(P＜0.05)，但仍较正常对照组减少(P＜0.05)。

表1 各组乳鼠心肌细胞活性比较±s

表1 各组乳鼠心肌细胞活性比较±s

与正常对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05

组 别 n OD值0.274 ±0.012模型组 8 0.189 ±0.020*药物干预组 8 0.223 ±0.018正常对照组8＊△

2.2 各组乳鼠心肌细胞AST含量比较 见表2。

表2 各组乳鼠心肌细胞AST含量比较U/L，±s

表2 各组乳鼠心肌细胞AST含量比较U/L，±s

与正常对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05

组 别 n AST正常对照组1.02 ±0.45模型组 6 3.96 ±0.88*药物干预组 6 2.55 ±0.67 6＊△

由表2可见，模型组AST含量较正常对照组升高(P＜0.05)，药物干预组 AST含量较模型组降低(P＜0.05)，但仍高于正常对照组(P＜0.05)。

3 讨论

四妙勇安汤是一首治疗脱疽的经典古方，由金银花、玄参、当归、甘草组成，具有清热解毒、活血止痛的功效。生脉饮是一首治疗气阴两虚证的经典古方，由人参、麦门冬、五味子组成，具有益气生津、敛阴止汗功效。

MTT比色法可用于研究心肌细胞的存活力［3］，是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT法的原理是活细胞线粒体含有的琥珀酸脱氢酶能够还原外源性的黄色MTT为不溶于水的紫蓝色沉淀物，这种沉淀物被称之为甲瓒(Formazan)并沉积于细胞中，但是死细胞则没有此种反应。在一定细胞数范围内，甲瓒的形成量与活细胞数量成正比，甲瓒形成量能够间接反映细胞的存活力。DMSO能溶解细胞中的沉淀物甲瓒，在酶标仪上选择波长490 nm处检测这种物质的光吸收值，从而间接地相对地反映存活状态的心肌细胞的数量，也就能够反映细胞的存活力。这种比色法的优点是灵敏度相对较高，经济，操作比较简单，能客观准确反映细胞的生存活力与药物作用的关系［4］;缺点是这种比色法只能用来检测细胞的相对数量，不能检测细胞的绝对数量，而且最重要的是该实验方法只能检测活细胞，对凋亡细胞、坏死细胞不能进行检测。本实验结果表明，药物干预组心肌细胞OD值明显高于模型组(P＜0.05)，心肌细胞活性增强。可能是四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液保护了缺氧/复氧损伤后心肌细胞的线粒体结构或者功能，从而促使甲瓒的生成量增多，显示该药液具有增加缺氧/复氧损伤后心肌细胞存活力的作用，可能起到了抑制心肌细胞凋亡的作用。

AST是临床上心肌酶化验项目中的一项，AST在心肌细胞中的含量最多，在肝脏及骨骼肌等器官组织中也含有AST，在血清中含量极少。对于在体外培养的心肌细胞，检测AST可以排除肝脏及骨骼肌对培养液中AST含量的影响。正常的心肌细胞几乎不释放AST。缺氧后心肌细胞的能量供应从有氧氧化转为无氧酵解，能量供应明显减少，细胞膜功能受损，通透性增大［5］，细胞对一定时间缺血缺氧后突然恢复的高浓度氧不能适应，细胞内生成大量的氧自由基导致细胞及细胞膜结构破坏，心肌细胞内释放大量酶［6］。本实验表明，与正常对照组相比，模型组、药物干预组培养液中AST含量升高(P＜0.05);而与模型组相比较，加入四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液后的药物干预组AST含量降低(P＜0.05)。从而可以推测，四妙勇安汤合生脉饮能够减轻缺氧/复氧后对心肌细胞造成的损伤，有可能是通过改善细胞的有氧代谢及抑制氧自由基对细胞的损伤从而改善细胞膜结构的完整性和功能的通透性，减少细胞释放到培养液中AST含量，从而起到了对心肌细胞的保护作用。

本研究表明，四妙勇安汤合生脉饮对缺氧乳鼠心肌细胞凋亡具有保护作用，其作用可能与四妙勇安汤合生脉饮能够提高缺氧/复氧损伤后心肌细胞的存活力、降低缺氧/复氧损伤后心肌细胞培养液中AST含量有关。

［1］刘真，魏运湘，于慧卿，等.四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响［J］.中国中医药信息杂志，2010，17(5):31-33.

［2］魏运湘，刘真，于慧卿，等.四妙勇安汤加味对急性心肌梗死患者心肌保护作用的疗效观察［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2010，8(6):664-665.

［3］关凤英，李红，孙巍.黄芪甲苷对新生乳鼠心肌细胞过氧化氢损伤的保护作用［J］.吉林大学学报:医学版，2007，33(2):211-214.

［4］余薇，查文良，吴基良，等.原代培养的心肌细胞中毒性心肌炎模型的建立［J］.山东医药，2008，48(2):6-7.

［5］张连东，杨兴易.MODS患者血清心肌酶变化及临床意义［J］.中国急救医学，2004，24(9):691.

［6］方显明，杨建设，顾国龙，等.益心脉颗粒对家兔心肌缺血再灌注心肌损伤保护作用的研究［J］.中国中医药科技，2003，10(2):78-80.

(本文编辑:曹志娟)

Investigation of Simiao Yongan decoction with Shengmai drink on AST and cardiomyocytes activity of hy-poxic neonatal rat

MENG Yunhui，YU Huiqing，WANG Qiang，et al.Department of Cardiology，Shijiazhuang Hospital of Traditional Chinese Medicine in Hebei Province，Hebei，Shijiazhuang050051

ObjectiveTo observe the effect of Simiao Yongan decoction combined with Shengmai drink on AST and cardiomyocytes activity of hypoxic neonatal rat.MethodsSimiao Yongan decoction with Shengmai drink was decocted and made by alcohol sedimentation.The combination of trypsin and collagenase was to isolate neonatal rat myocardial cells，which were purified twice by differential adhesion method and identified by immunocytochemical Methods Primary cultured neonatal rat cardiomyocytes were randomly divided into three groups，control group，model group，and treatment group.The myocardium viability was detected by MTT colorimetric method.And AST was determined by automatic biochemical analyzer.ResultsDrug intervention can improve the OD value of each well，lower AST levels，compared with the model group，the difference was significant(P＜0.05).ConclusionThe alcohol sedimentation solution of Simiao Yongan decoction with Shengmai drink played a protective role on myocardial apoptosis，which may be relative with the improvement of the myocardium viability and the decline of the AST content in culture media induced by hypoxia/reoxygenation treatment.

Simiao Yongan decoction;Shengmai drink;Cardiomyopathy;Myocyte;Heart;Model;Animal;Animal experiment

R542.2;R285.5;R289.3

A

1002-2619(2014)08-1228-03

※项目来源:河北省中医药管理局2011年度中医药类科研计划课题(编号:2011053)

孟云辉(1977—)，女，中西医结合副主任医师，博士。从事心血管疾病临床研究。

2013-08-15)