HLA－DPB1基因rs9277542多态性与乙型肝炎病毒感染的关系

熊国莲，陈骥，范陵，石菡，袁媛，邹愚，杨军，胡章勇

（成都医学院第一附属医院感染科，成都 610500）

乙型肝炎病毒（HBV）感染人体后主要表现为急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化及乙肝相关性肝癌等不同临床疾病谱。HBV主要受机体遗传、病毒及环境因素的交互作用影响，其中人体免疫因素起主要作用，某些与机体免疫应答相关的关键基因的单核苷酸多态性（SNP）影响HBV感染后结局［1，2］。近年来，不同地域学者证实了 HLA－DPB1基因3＇非编码区的rs9277535、rs9277542及 HLADPA1基因rs3077等位点与亚洲人群对HBV易感性及慢性HBV感染者表面抗原的血清学转换密切相关［3－7］，但是这些位点多态性是否影响慢性 HBV感染者的疾病进展仍存在较大的分歧。本研究拟对成都地区汉族人群中rs9277542位点的基因多态性与HBV感染后表现为不同临床疾病谱的相关性进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

参照2005年中华医学会《慢性乙型肝炎防治指南》，收集成都医学院第一附属医院2009年4月～2013年4月期间579例无血缘关系的慢性HBV感染者作为病例组，包括慢性HBV携带者222例，其中男136例，女86例，平均（35.9±11.5）岁；慢性乙型肝炎患者231例，其中男157例，女74例，平均（40.8±13.6）岁；乙肝肝硬化126例，其中男102例，女24例，平均（50.4±10.6）岁。另选取 HBV自限性感染者344例（简称自限性感染组）作为对照组，其中男167例，女177例，平均（41.59±14.43）岁。对照组均无肝病史，具有曾感染HBV证据（HBsAb、HBeAb和HBcAb 3种抗体至少2种阳性，HBsAg、HBeAg和 HBV DNA均为阴性）且未经治疗而恢复者。

1.2 基因分型

1.2.1 白细胞DNA的提取 抽取患者静脉血3 mL，采用TIANamp blood DNA kit血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，Nanodrop分光光度计检测DNA浓度和纯度，每份标本稀释至终浓度10 ng／mL，放入－20℃冰箱备用。

1.2.2 PCR 扩增及纯化 Primer Premier 5.0 设计 PCR 引 物，序 列：5′－CAAATCAAGTTTAGT GCCCTCA－3′（上 游 引 物 ），5′－GCTGCTGTGCA CTGATTGTGTG－3′（下 游 引 物），产 物 575bp。PCR反应条件：95℃2min预变性，然后94℃变性20s，65℃退火40s，72℃延伸1.5min，共11个循环；94℃ 20s，59 ℃ 30s，72 ℃ 1.5min，72 ℃ 2 min，共24个循环。PCR产物用虾碱酶及外切酶Ⅰ（ExoⅠ）纯化。

1.2.3 SNapshot技术进行rs9277542基因分型采用美国ABI公司的SNaPshot试剂盒进行单碱基延伸反应。SNapshot PCR反应体系10μL，其中纯化PCR产物2μL，SNapshot Multiplex Kit 5μL，引物1μL，双蒸水2μL。反应条件：96℃10s，52℃5 s，60℃30s，共28个循环。SNaPshot引物序列：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTTTTGCGT CTCATATTGACACCTTT。取0.5μL SNapshot纯化产物上样于ABI 3130XL测序仪测序，利用GeneMapper 4.1软件进行分析。所有检测样本在完成第1次检测后随机抽取5%样本进行重测，一致性100%。

1.3 统计学方法

用在线软件 DeFinetti program （http：／／ihg.gsf.de／cgi－bin／hw／hwa1.pl）作 病 例 组 和 对 照 组Hardy－Weinberg平衡检测。采用SPSS 18.0统计软件包进行数据分析，各组样品的基因型及等位基因频率比较采用χ2检验。二分类logistic回归分析计算经年龄和性别矫正的相对风险度的比值比（OR）及其95%可信区间（CI），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy－Weinberg平衡检验结果

利用χ2检验对579例慢性HBV感染者和344例HBV自限性感染者HLA－DPB1基因rs9277542位点多态性作Hardy－Weinberg平衡检验，结果均符合 Hardy－Weinberg遗传平衡（P＞0.05）。

2.2 两组rs9277542基因型和等位基因频率分布

CC、CT、TT及C、T等位基因频率在两组间比较差异有统计学意义（P＜0.0001）。对照组T等位基因及CT、TT基因型频率明显高于病例组。以C等位基因、CC基因型为对照，T等位基因、XT基因型为保护基因型（见表1）。

2.3 病例组不同亚组间rs9277542基因型分布频率比较

CC、CT、TT 3种基因型在慢性HBV携带者组和慢性乙型肝炎组间分布无统计学意义（见表2）。CC、TT基因型频率在慢性HBV携带者组、慢性乙型肝炎组与乙肝肝硬化组间的分布经性别和年龄校正后有统计学意义（见表3、表4）。

表1 自限性感染组与慢性HBV感染组rs9277542基因型和等位基因频率分布

表2 慢性HBV携带者组与慢性乙型肝炎组rs9277542基因型分布

表3 慢性HBV携带者组与乙肝肝硬化组rs9277542基因型分布

表4 慢性乙型肝炎组与乙肝肝硬化组rs9277542基因型分布

3 讨论

有研究表明，HLA－DP基因多态性与中国汉族人群慢性 HBV 感染及乙型肝炎重症化有关［5，8，9］。O＇Brien等［10］证实，在分子水平上，HLA－DP mRNA低水平表达是发生HBV持续感染的重要原因。Thomas等［11］报 道，与 rs9277542 紧 密 连 锁 的HLA－DPB1基因 rs9277534（G／A）多态性影响HLA－DP蛋白表达，携带主要基因型（G／G）人群外周血单核细胞表面HLA－DP蛋白表达水平和细胞内mRNA转录水平明显高于变异基因型（A／A）人群，并认为低水平 HLA－DP表达促进 HBV自发清除。

本研究结果提示：成都地区汉族人群 HLADPB1基因rs9277542位点多态性与感染HBV后自发清除HBV密切相关，其中携带T等位基因和CT、TT基因型者有更高概率发生HBV自发清除，与Nishida等［7］在日本人和韩国人中所作的全基因组关联分析（GWAS）结论一致。考虑HLA－DP分子在乙肝病毒抗原提呈、病毒清除过程中发挥重要作用，并可能参与了慢性乙型肝炎的发生、发展过程，本研究对病例组按不同疾病状态进行分析，结果显示：与慢性HBV携带者组和慢性乙型肝炎组比较，乙肝肝硬化组患者的CC、TT基因型的分布差异均有统计学意义。肝硬化组的TT及TT＋CT基因型频率显著高于慢性HBV携带者组和慢性乙型肝炎组，提示在成都地区汉族人群中，HLA－DPB1基因不仅参与HBV感染后自发清除的过程，还可能与慢性HBV感染者进展到肝硬化有关。

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