新构建FlaA N／C蛋白辐射防护相关miRNA芯片谱研究

许颖，王丹，石娇，周晓萍，王建，常晓松

（1.成都医学院第一附属医院检验科，成都 610500；2.四川出入境检验检疫局，成都 610041）

近年来，随着载人航天的发展、核电设施的建设以及核技术在军事、工业、农业和医疗中的应用普及，电离辐射作为一种不可避免的胁迫因素大量存在于人类工作和生活环境之中。尤其是如航天员、核电站工作人员、从事核相关医疗从业人员和肿瘤患者，暴露于辐射的机会较多，接受的累积辐射剂量也更大。因此，电离辐射防护和辐射病的诊疗显得尤为重要［1］。

课题组前期构建了基于嗜肺军团菌鞭毛蛋白的重组蛋白FlaA N／C，辐照实验表明，其在2h时相点预防性皮下注射的小鼠具有良好的辐射防护能力（专利申请号：201410075339.8）。鞭毛蛋白作为PAMP的一种，是目前为止发现的TLR5唯一配体，TLR5与鞭毛蛋白结合后，介导一系列炎症因子的转录调控，如 CTL、IL－8、G－CSF、IL－6、TNFα、SOD－2和IP－10等细胞效应因子。CBLB502的研究结果［2］提示，该辐射抗性作用途径为TLR5依赖的，通过NF－κB的激活产生大量的辐射保护因子（如G－CSF和IL－6等）所致。目前，鞭毛蛋白介导的辐射防护机制研究主要集中在基因组水平和蛋白水平，但其是否为辐射防护的唯一途径尚有待进一步研究，其转录后调控机制尚未开展。据此，课题组拟开展miRNA基因芯片研究，为FlaA N／C蛋白转录后调控机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

RNA质检时的分光光度计采用NanoDrop®ND－1000（Thermo Scientific，DE，USA）；RNA 质检时的安捷伦生物分析仪采用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies Genomics，CA，USA），芯片检测采用Agilent RNA 6000Nano Kit（Cat ＃ 5067－1511， Agilent Technologies Genomics，CA，USA）；芯片杂交使用控温杂交培养箱：Hybridization Shaking Oven （ OH－800D，Yihder，Taiwan）；芯片荧光扫描仪采用 Axon 4000B（Molecular Devices，CA，USA）。

1.2 动物实验

将8～10w龄雄性BALB／C小鼠10只分为两组：FlaA N／C组和空白对照组，每组5只。FlaA N／C组皮下注射FlaA N／C蛋白1μL／mg，2h后乙醚麻醉，采集小鼠小肠全段组织，用生理盐水洗净血液等杂物，液氮速冻。

1.3 RNA Extraction／RNA提取

取体积100μL冻存组织（每只小鼠各取等量组织混合），加1mL TRIzol reagent（Invitrogen Cat＃15596－026）及200mg 1.5mm mini－beads加入2 mL EP管中，以 mini－beadbeater（最大转速，15s，置冰上3min）重复击打4次，抽提过程全部保存于4℃，12 000g，4℃ 离心10min，去除沉淀及脂肪层后，室温静置5min将组织完全裂解，加入200 μL BCP，震荡15s，室温静置3min后，12 000g，4℃离心15min，取上清液500μL置于新管。加入2 μL（10μg）glycogen，上下反转3次混匀后，加入500μL 100%isopropanol再次上下反转3次直至匀相。静置室温10min沉淀，将沉淀物以80% 乙醇清洗两次后，加入30μL RNase－free ddH2O回溶。

1.4 Microarray Analysis／miRNA基因芯片分析

2.5 μg 总 RNA 通 过 NanoSep100K （pall corporation，USA）管柱富集出小RNA（＜200bp）片段，并通过 Vivaspin500 3K（sartorius stedim biotech）管柱脱盐后，利用ULSTM Labeling Kit（kreatech diagnostics，the Netherlands）试剂盒进行Cy5荧光标定。标定完成的小RNA杂交于已经过预杂交的Mouse miRNA OneArray v5芯片（phalanx biotech group，Hsinchu，Taiwan），杂交环境37℃，16h；清洗 WashI 37℃－5min，WashII 37℃－5min，WashIII 20次。芯片以离心方式甩干后，使用Axon 4000B荧光扫描仪进行讯号读取，并以GenePix 4.1软件 （molecular devices）进行数据处理。

芯片数据以R套组进行数据筛选、均一化及统计计算。去除在所有芯片flag＜0的探针，将同一探针重复的数据取中位数值，后以invariant set normalization方法进行样本间数据均一化，并以pair－wise T－test方法计算两两比对样本或组别间的差异倍数及P值。差异基因筛选条件设定为｜log2ratio｜≥0.8，P＜0.05。

1.5 差异miRNA生物信息学分析

针对差异的miRNAs进行靶基因预测及通路分析，采用miRNA靶基因预测及通路分析网站工具 miRSystem （http：／／mirsystem.cgm.ntu.edu.tw／index.php），整 合 7 个 靶 基 因 预 测 网 站（DIANA、miRanda、miRBridge、PicTar、PITA、rna22和TargetScan）及2个靶基因实证数据库（TarBase和miRecords），以至少4个网站均预测到靶基因为挑选原则进行筛选。

2 结果

2.1 miRNA芯片图谱及结果分析

在FlaA N／C皮下注射后2h，取小鼠肠组织进行miRNA的芯片研究，结果显示，有108个miRNA上调，59个miRNA下调（见图1）。

图1 FlaA N／C蛋白刺激小鼠肠组织miRNA芯片结果

2.2 生物信息学分析

经过生物信息学软件分析，通过对PUBMED收录的miRNA文献进行比对分析后发现，差异miRNA 预测靶点主要集中在 NF－κB、PI3K－Akt、p53和Caspase等信号通路，miRNA以上调居多，靶 点 主 要 位 于 TNF－α、TNF－R1、IL－1、NGF／CASP3／Bcl－2／XL、IRAK1／2、IKK／IAP、PI3K、Akt／PKB、PKA和 Bcl－2，其余 miRNA 靶点还涉及WNT、VEGF和NOTCH等信号通路（见表1）。

表1 NF－κB、PI3K－Akt、p53和Caspase等信号通路相关差异miRNA与预测靶蛋白

3 讨论

miRNA是一类约22～25个碱基的内源性非编码小RNA，通过与靶基因mRNA的3＇UTR结合抑制蛋白翻译。据推测，可编码蛋白的基因大约有60%受 miRNA 调 控［3，4］，一 些 具 有 特 异 功 能 的miRNA已被报道［5，6］。miRNA和信号通路在机体行使功能中具有重要作用，信号通路可调控miRNA转录、加工成熟和功能发挥，同时miRNA可调节信号通路的信号级联放大、信号通路之间的cross－talk和信号网络鲁棒性［7］。因此，研究miRNA网络与信号通路的相互调控在FlaA N／C介导辐射防护中的作用，将有助于深刻理解辐射和生物学效应的分子机制，从而为开发有效的辐射防护方法提供理论支持，并可为临床放疗提供可能的分子生物学治疗手段。

鉴于辐射防护在军事、医疗等领域的重要性日益凸显，近年来辐射防护相关研究逐步受到关注。对辐射防护相关miRNA的研究［8，9］表明，人和鼠正常细胞、癌细胞、肿瘤组织在辐照后miRNAs表达谱均出现改变，同时离子辐射后能够导致机体多种信号途径的激活，包括P53通路、JNK通路、MAPK级联反应和 NF－κB激活，以保证宿主抗辐射损伤［10，11］。

本课题针对差异的miRNAs进行了靶基因预测及通路分析，通过对PUBMED收录的miRNA文献进行比对分析后发现，在表达谱中异常改变非常显 著 的 miR－21、mmu－let－7 家 族、miR－122、miR－126、miR－146a、miR－181 家 族、miR－200 家 族 和miR－30家族等miRNAs及其预测靶蛋白主要集中在 NF－κB、PI3K－Akt、p53和Caspase等与凋亡密切相关的通路。肿瘤细胞内Caspase家族蛋白表达降低或活性减弱是肿瘤细胞产生辐射耐受性的重要原因之一［12］。抑制 Bcl－2、Bcl－XL表达能够增敏癌细胞辐射抗性［13］，持续性表达 NF－κB是导致肿瘤细胞抗凋亡的重要原因，同时也是导致肿瘤辐射防护能力增强的重要机制［2］。Chang等［14］对前列腺癌的研究表明，PI3K／Akt／mTOR通路的激活能够抑制凋亡，增加前列腺癌细胞的辐射抗性，Caspase 3的激活能够降低肿瘤细胞辐射抗性［15］，p53信号通路的激活也能够有效增敏辐射抗性［14，16］。

研究［17，18］表明，肿瘤细胞的抗凋亡机制在介导肿瘤细胞的辐射防护抗性方面具有重要作用。近年来，围绕分子靶向抗凋亡蛋白的研究为肿瘤放疗提供了 新 的 技 术 手 段［19，20］，CBLB502 的 研 究［2］表 明，持续活化的NF－κB通路是引起肿瘤细胞抗凋亡的的重要原因之一，而且其抗凋亡作用最终介导了小鼠的辐射防护能力，但其转录后调控机制尚不清楚，有待进一步设计实验开展研究。本实验中PI3KAkt、p53和Caspase等与凋亡密切相关通路的发现，为进一步拓展新的辐射防护机制提供了思路，有必要以凋亡为切入点开展FlaA N／C蛋白介导的肠黏膜上皮细胞辐射防护转录后调控机制研究。

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