滋肾育胎丸对滋养细胞凋亡的影响及其作用机制研究

张嵩卉，张兰珍，赵 赫，勾晨雨

(1.广州医科大学附属第二医院，广东广州510260;2.第四军医大学，陕西西安710032)

已知胎盘细胞过度凋亡和凋亡与增殖之间的平衡紊乱在复发性流产、胎儿生长受限(FGR)的发病机制中起决定性作用[1]。临床常用的治疗复发性流产、FGR的药物，如地屈孕酮、丹参等就有抗滋养细胞凋亡作用。使用滋肾育胎丸结合西药治疗复发性流产等疾病虽已取得明显临床效果，但其具体作用机制并未完全明了。既往研究提示，与滋肾育胎丸组方成分近似的安胎养血方剂可通过减少肾小管上皮细胞凋亡影响移植肾功能[2]，据此猜测滋肾育胎丸也可能通过调控滋养细胞凋亡发挥疗效。本研究旨在研究药物作用机制，为中成药的临床应用提供实验依据。

1 实验资料

1.1 一般资料 随机选择2012年10月—2013年2月在广州医科大学附属第二医院因社会因素行剖宫产的健康单胎产妇20例，产妇年龄21～33岁，孕38～39周，无其他妊娠并发症。

1.2 主要试剂来源 滋肾育胎丸粉剂由广州白云山中一药业有限公司提供。细胞培养所用的DMEM、血清、Ham.sF12、HEPES及胰酶购自Gibco，Percoll细胞分离液购自Phamacia，AnnexinV－FITC凋亡检测试剂盒购于联科生物。鼠抗人Fas单克隆抗体、鼠抗人 FasL单克隆抗体、内参β－actin、抗 β－actin抗体和相应的第二抗体均购自Santa Cruz。其余常规试剂为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 滋肾育胎丸提取制备 按比例称取药材于500 mL三角瓶中，加15倍量95%乙醇，60℃条件下水浴振荡提取2h，取出过滤。将滤渣二次浸提后过滤，合并2次所得滤液，减压浓缩，干燥后即得滋肾育胎丸提取物粉末，约占滋肾育胎丸总质量2.2%。

1.3.2 分离和培养滋养细胞 原代滋养细胞培养参考肖敏等[3]的报道，采取胰酶消化Percoll密度梯度分离法。取剖宫产术后无菌胎盘组织裁出绒毛组织，经Hank’s液清洗3次，将绒毛组织剪碎后用0.25%胰蛋白酶及20 IU/mL DNaseⅠ胶原酶Ⅰ于37℃消化30 min。消化液经100目金属筛网过滤后1000 r/min离心10 min，DMEM重悬细胞。收集细胞悬液2mL加于Percoll分离液上层，以2500 r/min离心20 min，吸取中层细胞，置于DMEM/Ham.sF12(1∶1)(含20%胎牛血清，25 mmol/L HEPES和4 mmol/L谷氨酰胺)调整细胞浓度至1×109L－1，于37℃孵箱内培养。4 h后Hank’s液清洗3次去除未贴壁细胞后将贴壁细胞分别置于正常环境、缺氧环境、缺氧+不同浓度滋肾育胎丸溶液(10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)环境下培养。缺氧环境培养箱提供p(O2)＜15 mmHg(1%～2%O2+5%CO2+93%N2，1 mmHg=0.133 kPa)，正常培养环境提供p(O2)100 mmHg(5%CO2+95%空气)。细胞培养至72h。

1.3.3 流式细胞仪检测滋养细胞凋亡率 将各组细胞分别用2.5 g/L胰蛋白酶消化，洗涤后用PBS调整细胞密度为1×109L－1，1000 r/min、4 ℃离心10 min，弃上清 ;加入1 mL 预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮;1000 r/min，4℃离心10 min，弃上清;重复后2个步骤后再将细胞重悬于200 μL Binding Buffer;加入10 μL Annexin V－FITC轻轻混匀，避光室温反应15 min。加入300 μL Binding Buffer(总反应体积500 μL)以及5 μL PI，上机检测，共测5次，结果取平均值。

1.3.4 Western blot法检测滋养细胞Fas/FasL蛋白表达量参照文献[4]的方法在细胞培育24 h后收集蛋白。取50 μg蛋白上样至100 mg/L SDS2聚丙烯酰胺凝胶，在恒压80 V下电泳分离后，以恒压120 V将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入封闭缓冲液室温振荡1 h，加入一抗(Fas抗体浓度为1∶500，FasL抗体浓度为1∶1000)，4℃孵育过夜，洗膜后加二抗(1∶500)，室温孵育1 h，洗膜后显色，曝光显影定影。Fas及FasL表达强度以与β－actin的比值表示，即为目的蛋白表达量的半定量结果。

1.4 统计学处理 所有数据输入计算机，由SPSS 19.0统计软件进行统计分析处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示，进行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞术检测结果 将各组滋养层细胞用Annexin－V－FITC与PI双染后，流式细胞术显示培养24 h后细胞凋亡情况。其中正常组滋养细胞凋亡率为(4.8±1.4)%，低氧组滋养细胞凋亡率为(14.8±2.0)%，10 mg/L滋肾育胎丸+低氧组滋养为(12.2±1.8)%，50 mg/L滋肾育胎丸+低氧组为(11.8±1.1)%，100 mg/L 滋肾育胎丸 +低氧组为(8.4 ±1.1)%。独立样本t检验显示，低氧组滋养细胞凋亡率高于正常组及中、高浓度滋肾育胎丸+低氧组(P均＜0.05)。低浓度滋肾育胎丸+低氧组细胞凋亡率高于正常组及中、高浓度滋肾育胎丸+低氧组(P均＜0.05)，但与低氧组比较无显著性差异(P＞0.05)。中等浓度滋肾育胎丸+低氧组细胞凋亡率高于正常组及高浓度滋肾育胎丸+低氧组(P均＜0.05)。

2.2 Western blot法检测结果 体外培养环境下，滋养细胞Fas、FasL蛋白均为阳性，且Fas蛋白表达量均略低于FasL蛋白的表达量。培养24 h后显示低氧环境对Fas、FasL具有上调作用。而中、高浓度滋肾育胎丸组Fas、FasL表达明显减少，见表1。

表1 各组滋养细胞Fas、FasL表达指数(±s)

表1 各组滋养细胞Fas、FasL表达指数(±s)

注:①与正常组比较，P ＜0.05;②与低氧组比较，P ＜0.05。

组别Fas FasL正常组0.544 ±0.2020.976 ±0.241低氧组 0.725 ±0.345① 3.452±0.472①10 mg/L滋肾育胎丸+低氧组 0.696±0.362① 3.173±0.336①50 mg/L滋肾育胎丸+低氧组 0.671±0.314①② 2.033±0.157①②100 mg/L滋肾育胎丸+低氧组 0.633±0.293①② 1.984±0.145①②

3 讨论

3.1 利用物理缺氧制造的低氧环境可增加体外滋养细胞凋亡率 制造体外培养缺氧环境观察细胞理化性状改变逐渐成为深入研究滋养细胞特性的手段。国内外已有研究选用早孕期滋养细胞为对象，得到的实验结论可直接反映早孕期滋养细胞在缺氧条件下的病变特点，但无法证明妊娠中晚期滋养细胞在相同条件下是否有同样表现。本实验取足月妊娠滋养细胞进行正常条件及缺氧条件下的培养，结果显示低氧环境可增加足月妊娠滋养细胞的凋亡率，验证了以物理缺氧法体外模拟缺氧环境的可重复性。虽然控制和维持物理缺氧条件稍有困难，但物理缺氧无疑最接近真实生理缺氧状态，而且同化学缺氧法相比，物理缺氧法更适合根据不同实验要求调整缺氧时间及程度。在大多数实验室低氧培养箱相对普及的条件下，物理缺氧法值得继续在实验中使用。缺氧可导致滋养细胞凋亡在此前的研究中已得到证实，但与相同缺氧条件下的早孕期滋养细胞凋亡率(32.9±9.7)%相比[5]，本实验中妊娠晚期滋养细胞的凋亡率(14.8±2.0)%偏低。这一结果间接提示，妊娠早期滋养细胞对缺氧环境较妊娠晚期可能更敏感。

3.2 滋肾育胎丸可抵抗缺氧造成的晚孕滋养细胞凋亡 本实验结果显示低浓度滋肾育胎丸组对低氧造成的细胞凋亡无抑制作用，而中、高浓度滋肾育胎丸组均对低氧造成的细胞凋亡有抑制作用，且高浓度组较低浓度组抑制作用更明显。提示滋肾育胎丸所起的抑制凋亡作用与药物浓度成正比，存在剂量依赖关系。滋肾育胎丸由党参、续断、白术、巴戟天、何首乌、杜仲、菟丝子、熟地黄等组成，是我国著名中医学家罗元恺教授在传统组方寿胎丸基础上改良制定的经验方，是国家中药保护品种，并已由广州中一药业规模化生产。在临床广泛应用于脾肾两虚、冲任不固的滑胎、月经不调、不孕症的治疗[6]。传统医学认为肾主生殖，在辨证上认为气虚血瘀是导致滑胎、胎萎不长等病症的主因。而现代医学从细胞学、分子生物学角度的研究已充分证实缺氧可导致滋养细胞过度凋亡，继而影响胎盘血运。故应从益气活血、改善胎盘循环、提高滋养细胞外氧浓度方面着手治疗以上疾病。滋肾育胎丸组方中的部分药物成分，如菟丝子黄酮已被提出可能通过减少线粒体CytC的溢出，降低Caspase－3活性，从而降低衰老模型小鼠心肌细胞的凋亡率[7]，或可通过对抗雷公藤多苷所致雄性幼鼠睾丸组织Bcl－2蛋白表达减少和Bax蛋白表达增强而增强雄性幼鼠生育能力[8]。而桑寄生主成分为萹蓄甙、黄酮类化合物、齐墩果酸、槲皮素等，有促胚胎发育及抑制子宫收缩的作用。单一成分的药效固然肯定，但纵观国药发展历史，流传久远的方剂往往依各组分的药理性能严格遵循君、臣、佐、使，阴阳协调的机制，依优势互补原则进行调配，疗效也较单一组分更加确实和明显。

3.3 滋肾育胎丸可通过Fas/FasL途径影响滋养细胞凋亡Fas/FasL分属于肿瘤坏死因子及其受体家族，介导经典的细胞死亡受体通路。既往研究发现母胎界面的羊膜、绒毛膜、蜕膜层中均有Fas及FasL表达。正常妊娠时，来自胎儿的抗原成分可刺激母体T淋巴细胞大量表达Fas，而滋养细胞则通过表达一定量的FasL与T细胞表面的Fas结合诱导该T淋巴细胞凋亡从而获得免疫逃逸。既往研究显示病理妊娠时胎盘部位细胞凋亡较正常妊娠时明显增加，而Fas/FasL的表达明显减少[1，9]。此现象被解释为由于滋养细胞对FasL表达下降导致母体对滋养细胞杀伤作用增强，并最终导致疾病的发生。而其他组织在缺氧/复氧过程中的研究显示细胞凋亡增多时伴有Fas/FasL表达增加[10]。本研究结果显示离体环境下滋养细胞在缺氧时Fas的表达量与正常环境下比较无明显差异，而FasL则在缺氧条件下明显升高，提示缺氧条件下滋养细胞凋亡与FasL活跃有关。本实验中，随滋肾育胎丸溶液浓度升高，缺氧条件下的滋养细胞表达FasL减少，与此同时滋养细胞凋亡率下降，提示滋肾育胎丸抑制滋养细胞凋亡的作用与促使滋养细胞减少对FasL表达有关。

3.4 对滋肾育胎丸治疗FGR的预期 目前滋肾育胎丸在临床中的应用不包括对FGR等中晚孕期病症的治疗。对国内外文献的回顾性分析结果显示，尚无针对FGR的特效治疗方法和突破性治疗进展。西医治疗FGR的主要手段是改善胎盘微循环及营养支持治疗，但存在药物作用单一及有较多禁忌证等缺点。在漫长的临床实践中，利用中医药治疗FGR切实取得了一些经验，但总体而言，中药的使用仍未摆脱小范围、经验性用药的简单模式。对中药具体作用机制的深入研究相对匮乏，缺乏药理基础。对FGR患者的胎盘研究发现，缺氧可导致滋养细胞增殖减少，凋亡增加，细胞功能障碍[4]。本实验选用妊娠晚期滋养细胞为研究对象，证实滋肾育胎丸对缺氧导致的妊娠晚期滋养细胞的异常凋亡有抑制作用。这一结果从药物作用基础层面解答临床用药的可行性，无疑为应用滋肾育胎丸治疗FGR提供了一个良好预期。根据中医学“异病同治”的理论，本实验对已在临床成熟使用的滋肾育胎丸提出了更广阔的应用方向，希望在进一步的临床用药中得到更确实的疗效验证。

[1] Longtinea MS，Chena B，Odiboa AO，et al.Villous trophoblast apoptosis is elevated and restricted to Cytotrophoblasts in pregnancies complicated by preeclampsia，IUGR，or preeclampsia with IUGR[J].Placenta，2012，33(5):352－359

[2] 王巍，毕旭东，孙德光，等.安胎养血合剂对大鼠移植肾 Fas/FasL基因表达及细胞凋亡的影响[J].中国中西医结合外科杂志，2008，14(1):43 －46

[3] 肖敏，凌斌，姚凤球，等.人胎盘滋养层细胞的分离和鉴定[J].中国妇幼保健，2008，23(18):2567 －2569

[4] 金峰，乔宠，尚涛.胎儿生长受限患者血清和胎盘的Fas与FasL蛋白变化及意义[J].生殖与避孕，2011，31(3):205－207

[5] Levy R，Smith SD，Chandler K，et al.Apoptosis in human culured trophoblast is enhanced by hypoxia and diminished by epidermal growth factor[J].Am J Physiol Cell Physiol，2000，278(5):C982－C988

[6] 赵颖，曹蕾，罗颂平.滋肾育胎丸的临床应用与研究[J].世界中医药，2011，6(4):318 －319

[7] 孙守丽，欧芹，魏晓东，等.菟丝子复方制剂对衰老小鼠心肌CytC和caspase－3的影响[J].中国老年学杂志，2011，31(2):284－286

[8] 马腾，丁樱.菟丝子黄酮对雷公藤多苷损伤雄性幼鼠睾丸组织凋亡相关蛋白Bcl－2和蛋白Bax表达的影响[J].中医学报，2011，26(11):1342－1344

[9] Karowicz-Bilińska A，Szczerba A，Kowalska-Koprek U，et al.The evaluation of selected indices of apoptosis in placentas from pregnancies complicated by fetal growtHRestriction[J].Ginekologia Polska，2007，78(7):521 －526

[10] 郑世营，张晓膺，李虹，等.参附注射液对心肌细胞缺氧及缺氧/复氧时 Fas/FasL表达的影响[J].中国急救医学，2005，25(12):893－895