长期限食对大鼠颈内动脉嘌呤受体反应性调节的影响

武 懿，李晓丽，武广义，李 璐

(1.河北大学附属医院，河北保定073200;2.冀中能源峰峰集团总医院，河北邯郸056200)

随着人们生活水平的提高，糖尿病、高血压、高血脂和心脏病的发病率也随之增高。为了改善生活质量，有关限制饮食减少老龄化相关疾病的发生发展以及在退行性疾病中的作用机制受到日益关注。研究发现限制饮食可显著降低稳态胰岛素抵抗指数，升高胰岛素敏感性以及胰岛β细胞的分泌功能，使血浆游离脂肪酸以及总胆固醇含量降低，从而间接改变动脉粥样硬化的进展[1]。Heilbronn等[2]发现限食对高密度脂蛋白胆固醇和三酰甘油的影响具有性别差异，隔日限食3周可升高女性受试者血液高密度脂蛋白胆固醇，降低男性受试者三酰甘油水平。Fontana等[3]研究指出限食6 a可显著降低受试者血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、三酰甘油、超敏C反应蛋白、血小板衍化生长因子AB等冠状动脉粥样硬化危险因子，并使受试者的收缩压及舒张压显著下降，升高高密度脂蛋白水平;而且长期限食使颈动脉内膜中层厚度减少约40%，成为降低动脉粥样硬化风险的有力证据。动物实验证实，限食可显著降低SD大鼠心肌缺血区域心肌细胞凋亡率以及心肌梗死面积，并抑制受累心肌区域的炎性反应[4]。在限食对血管功能影响方面，发现母体孕期限食可降低胎儿出生后小肠系膜动脉内皮依赖性舒张反应[5]。同时，笔者研究发现长期限食不影响大鼠去内皮尾动脉平滑肌的肌性收缩反应，但显著增强P2X1受体和α1受体介导的血管收缩反应[6]。本研究拟观察长期限食对大鼠颈内动脉不同受体介导收缩反应的影响，以评估脑组织的供应血管颈内动脉与外周血管尾动脉的收缩反应在长期限食后可能存在的差异。

1 实验资料

1.1 仪器、药品及药液配制 去甲肾上腺素(NA)、乙酰胆碱(ACh)、α，β －亚甲基 ATP(α，β －MeATP)、脱氧皮质酮、吲哚美辛、普萘洛尔和地昔帕明均由Sigma公司提供。ERT884四道生理记录仪和张力换能器由河南开封友林电子有限公司提供。精确称取一定量药物，加入双蒸水定容，配制成一定浓度的母液，母液贮存于棕色瓶中，置－20℃冰箱内备用。临用前取一定量的溶液，以双蒸水按倍比稀释成所需浓度的溶液。脱氧皮质酮溶于丙二醇;吲哚美辛由乙醇稀释到所需浓度。

1.2 实验动物和分组 雄性Wistar大鼠，周龄12～13周，体质量300～350 g。大鼠购入后，适应性饲养3 d。随机分为 2组:限食组(FRG)18只，大鼠每天18:00给予日饮食量的50%[6]，自由饮水。对照组(CG)18只，大鼠自由饮食。

1.3 大鼠离体颈内动脉环的制备 大鼠分组饲养3周后，25%乌拉坦1.5 g/kg皮下注射进行麻醉，经股动脉放血处死后，颈部正中切开皮肤，暴露颈总动脉，剪取左右颈内动脉，即颈总动脉分叉至颅骨段，迅速置于4℃改良K－H液(Krebs－Henseleit solution)。仔细剔除血管周围的结缔组织，并用表面粗糙的铜丝去除血管内皮，截取3～4 mm宽的血管环置于(37±0.5)℃ K－H液中，持续通以95%O2和5%CO2的混合气体，对血管环施以1 g静息张力[7]，用ERT－884四道生理记录仪记录血管的张力信号。在平衡期间，每15 min更换1次恒温的K－H液以供应动脉所需的养分。平衡1 h后，用去甲肾上腺素(NA)3×10－7mol/L预收缩血管，用乙酰胆碱10－6mol/L检验血管内皮的完整性。

1.4 实验设计 将 2组中不产生任何舒张反应的标本进行进一步实验。首先建立NA(10－9～10－4mol/L)的收缩反应曲线以观察血管的收缩反应性，剔除在血管标本制备过程中对血管产生损伤的标本;其次，每组进一步分成NA组和α，β－MeATP组，检测NA累积给药和α，β－MeATP单浓度给药诱发血管的收缩反应;最后，所有标本于实验结束前累积给予KCl(10～120 mmol/L)，记录KCl诱发的收缩反应。并于实验结束后去除标本多余水分称量标本湿质量。

1.5 统计学处理 NA、α，β－MeATP和KCl诱发的血管收缩反应以标本张力(g)/标本湿质量(mg)的均数±标准差表示。利用统计软件计算3种血管激动剂诱发收缩反应的EC50值。组间比较采用双因素方差分析(two－way ANOVA)比较2条浓度－反应量效曲线，两对应浓度间的药物效应比较采用Bonferroni检验。标本湿质量、KCl最大收缩反应以及3种激动剂收缩反应的EC50值比较采用非配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。用Graph Pad Prism软件进行统计学分析及图形处理。

2 结果

2.1 2组对大鼠颈内动脉标本湿质量比较 对照组与限食组颈内动脉的标本湿质量分别为(0.65±0.11)mg和(0.61±0.11)mg，2组比较无显著性差异(P＞0.05)。

2.2 2组颈内动脉标本的收缩反应性比较 在 2组中，首次累积给予NA后，NA诱发的血管收缩反应均呈浓度依赖性。双因素方差分析结果显示，2组颈内动脉标本的血管收缩反应性均无显著性差异(P＞0.05)。见图1 和图2 。

图1 对照组大鼠颈内动脉血管收缩反应性

图2 限食组大鼠颈内动脉血管收缩反应性

2.3 2组NA诱发大鼠颈内动脉收缩反应的比较 与对照组比较，长期限食后NA诱发大鼠颈内动脉血管收缩反应增大(P＜0.01)，见图3 ;10－4mol/L NA诱发的收缩反应增大了19.42%。NA诱发收缩反应的－log EC50值在对照组和限食组分别为(7.40 ±0.24)mol/L 和(7.23 ±0.10)mol/L，2组比较无统计学差异(t=1.9840，P=0.0647)。

图3 NA诱发 2组大鼠颈内动脉血管收缩反应

2.4 2组α，β－MeATP诱发颈内动脉收缩反应的比较 与对照组比较，长期限食明显增大了α，β－MeATP诱发的收缩反应(P＜0.01)，见图 4;10－4mol/L α，β －MeATP 诱发的收缩反应增大了21.76%。α，β－MeATP诱发收缩反应的－log EC50值在对照组和限食组分别为(5.18±0.11)mol/L和(5.14±0.19)mol/L，与对照组比较，限食 3周对 α，β －MeATP 的 －log EC50值无明显影响(t=0.3210，P=0.7565)。10－4mol/L α，β－MeATP诱发颈内动脉收缩反应与同浓度NA诱发收缩反应的比值在对照组和限食组分别为43.02%和 43.76%。

图4 α，β－Me ATP诱发 2组大鼠颈内动脉血管收缩反应

2.5 2组KCl诱发颈内动脉收缩反应的比较 大剂量KCl(120 mmol/L)可对血管收缩产生损伤作用，使血管收缩值降低。与对照组比较，长期限食明显增大了KCl诱发的收缩反应(P＜0.01)，见图5 ;KCl诱发颈内动脉收缩反应的最大反应增加了36.63%。KCl在大鼠颈内动脉诱发收缩反应的EC50值对照组和限食组分别为(22.88±3.72)mmol/L和(22.52±2.39)mmol/L，2组比较无统计学差异(t=0.2338，P=0.8185)。

图5 KCl诱发 2组大鼠颈内动脉血管收缩反应

3 讨论

不同程度的限食可使血三酰甘油、总胆固醇水平降低，同时长期低热量饮食可使丙二醛水平明显减低，并抑制体内组蛋白去乙酰化酶，从而减轻氧化应激反应，使细胞免于老化并提高抗氧化能力[8]，降低动脉粥样硬化的风险，延缓年龄相关性心脏自主功能的下降。对血管舒缩功能的研究中，笔者也曾发现长期限食可增强大鼠尾动脉嘌呤受体和肾上腺素受体介导的血管收缩功能。为评估长期限食对不同部位血管是否产生类似的影响，本研究采用相同的方法研究了长期限食后大鼠颈内动脉不同受体介导的血管收缩反应，以观察限食对重要脏器－脑组织供血动脉的影响。本实验发现长期限食可增强大鼠颈内动脉P2X1受体与α1受体介导的血管收缩反应，这与笔者系列研究报道的长期限食可使大鼠尾动脉P2X1受体与α1受体介导的收缩反应增强一致[6]，同时也发现α，β－MeATP和NA在颈内动脉诱发最大收缩反应的比值未受到长期限食的影响，与文献[6－7]报道的结果一致，提示长期限食可增强大鼠不同部位血管神经源性收缩，从而增强P2X1受体与α1受体介导的血管收缩功能。

除限食增加P2X1受体与α1受体介导的血管收缩反应外，本研究还发现长期限食增加了大鼠颈内动脉KCl诱发的收缩反应，但对KCl诱发收缩反应的EC50值无影响，这与既往报道的限食对大鼠尾动脉KCl诱发最大收缩反应的影响略有不同[6]。Li等[9]报道力竭游泳运动对大鼠颈内动脉与尾动脉等外周动脉具有选择性抑制作用。提示在非生理情况下，大鼠颈内动脉与尾动脉的血管收缩反应可出现不同的变化。目前研究认为不同部位血管的缩血管纤维分布密度不同，在皮肤血管缩血管纤维分布最密，而在脑血管分布最少。颈内动脉作为脑组织的主要供应血管之一，在组织结构上必然与尾动脉存在差异，但尚不能对研究结果给予合理的解释，有待于进一步的研究。

综上所述，长期限食可增强大鼠颈内动脉血管神经源性收缩，从而增强P2X1受体与α1受体介导的血管收缩功能，同时增强其肌性收缩作用，但对缩血管受体结合率无明显影响。

[1] 孙倩倩，王双，王凌霄.成年大鼠接受高脂饮食或热量限制饮食对其衰老后身体构成、糖脂代谢及胰岛内β、α细胞分泌功能影响的比较研究[J].中华老年多器官疾病杂志，2012，11(9):653－658

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[3] Fontana L，Meyer TE，Klein S，et al.Long-term calorie restriction is highly effetctive in reducing the risk for atherosclerosis in humans[J].PNAS，2004，101(17):6659 －6663

[4] Ahmet I，Wan R，Mattsnn MP，et al.Cardioprotection by intermittent fasting in rats[J].Circulation，2005，112(20):3115 － 3121

[5] Alves GM，Barao MA，Odo LN，et al.L － Arginine effects on blood pressure and renal function of intrauterine restricted rats[J].Pediatr Nephrol，2002，17(10):856 －862

[6] 武懿，李璐，郭小俊.长期限食对大鼠尾动脉P2X1受体和α1受体介导血管收缩反应的影响[J].中国医药导报，2013，10(12):19－21

[7] Li L，Jia ZH，Chen C，et al.Physiological significance of P2X receptor-mediated vasoconstriction in five different types of arteries in rats[J].Purinergic Signalling，2011，7(2):221 －229

[8] Shimazu T，Hirschey MD，Newman J，et al.Suppression of oxidative stress by β － hydroxybutyrate，an endogenous histone deacetylase inhibitor[J].Science，2013，339(6116):211 － 214

[9] Li L，Wu T，Wei C，et al.Exhaustive swimming differentially inhibitSp2X1receptor-and α1－ adrenoceptor-mediated vasoconstriction in isolated rat arteries[J].Acta Pharmacol Sin，2012，33(2):221 －229