蓝莓米酒中总花色苷含量的测定

张采　沈晓同

摘 要：采用消光系数和pH示差2种方法对自制蓝莓米酒中总花色苷含量进行测定，测定值分别为16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2种方法均较为准确地反映了样品在溶液体系中的浓度，消光系数法所测值略小于pH示差法，后者操作难度比前者大。建议相关产品研发时可选用较为简便的消光系数法，最终产品选用较为准确的pH示差法。

关键词：蓝莓米酒；花色苷；pH示差法；消光系数法

中图分类号 TS26 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）08-163-03

Abstract：Total anthocyanin content in blueberry rice wine was determined by the extinction coefficient and pH-differential methods，measured values ??were 16.82（±0.36）mg/100mL and 17.48（±0.40）mg/100mL. Both methods were more accurate reflection of the sample concentration in the solution of the system. The content tested by extinction coefficient was slightly smaller than the pH-differential method，the latter operation was more difficult than the former. We suggested product development time can be used extinction coefficient method，it was more simple，and the final product selected pH-differential method，it was more accurate.

Key words：Blueberry rice wine；Anthocyanin；pH-differential method；Extinction coefficient method

蓝莓（blueberry）属杜鹃花科越橘属的一种，多年生落叶或常绿灌木。其果实为浆果，呈深蓝色，披白霜，近圆形，皮薄籽小，具有极高的营养价值[1]。蓝莓果实中花青素含量极高，花青素与糖以糖苷键结合形成花色苷（Anthocyanin），花色苷是以黄酮核为基础的一类物质中能呈现红色的一族化合物[2]。近30a间，关于蓝莓花色苷具有的抗氧化作用及其他生物活性的研究报道急剧攀升[3-5]，新开发的产品如雨后春笋般涌现出来，但大多未明确标出功效成分花色苷的含量，消费者在选购时缺乏参考依据。

总花色苷的定量方法主要是根据其光学特性进行分析，包括分光光度法中的色价法、pH示差法、消光系数法[6-7]，另外还有高效液相色谱法等。高效液相色谱法定量测定花色苷含量精确度虽高，但设备仪器较昂贵，需要标准品，且花色苷标准品很不稳定，从而限制了这种方法的广泛使用；色价法是花色苷的百分比值，不能准确表示溶液的浓度含量。本研究旨在比较pH示差法和消光系数法测定自主研发的蓝莓米酒产品总花色苷的差异，从而为其他产品花色苷的测定提供参考。

1 仪器与试剂

UV-1801紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器有限公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；LD4-2A型低速离心机：北京雷勃尔有限公司；EL204电子天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；95%乙醇、氯化钾、醋酸、醋酸钠、盐酸均为分析纯。蓝莓米酒由苏州市职业大学发酵食品实验室自酿。

2 方法

2.1 蓝莓米酒发酵工艺

2.2 试剂配制 1.86g/L的盐酸-氯化钾缓冲液（pH=1.0）；54.43g/L的盐酸-醋酸钠缓冲液（pH=4.5）；酸化乙醇（95%乙醇-1.5mol/L盐酸体积比85∶15）。

2.3 样品制备 移取适量10mL蓝莓米酒原液用酸化乙醇定容至50mL，室温静置过夜后4 000r/min离心10min，过滤，取上清液备用。

2.4 花色苷含量测定

2.4.1 消光系数法[8] 取待测液5mL放入比色管中，用酸化乙醇稀释至25mL，使其比色测定时吸光度值在0.2～0.7。由于花色苷在紫外波长下的吸收易混淆于其它类黄酮类化合物，故紫外分光光度计在400～800nm波长范围内扫描，以蒸馏水为参比，在其最大吸收波长处测定待测液的吸光度。花色苷含量计算公式如下：

A=Amax （1）

C（mg/100mL）=[（A×V1）/（98.2×V2）]×100 （2）

式中，Amax：最大吸收波长处的吸光度值；V1：定容体积（mL）×稀释倍数；V2：样品体积（mL）；98.2：花色苷平均消光系数。

同一样品平行测定6次，计算出花色苷含量，精密度用相对标准偏差来表示。

2.4.2 pH示差法[7，9] 各取2.5mL待测液放入2只比色管中，分别用pH1.0的盐酸-氯化钾缓冲液和pH4.5的盐酸-醋酸钠缓冲液定容至10mL，避光阴凉处平衡90min。

平衡好的试样上紫外分光光度计检测，用蒸馏水作对照，紫外分光光度计在400～800nm波长范围内扫描，分别测定蓝莓米酒花色苷在pH1.0和pH4.5缓冲液中的最大吸收波长和最大吸收波长处的吸光度值。

根据FULEKI T的研究，结合比耳定律，花色苷含量的计算公式：endprint

A=（Amax-A700）pH1.0-（Amax-A700）pH4.5 （3）

C（mg/100mL）=[（A×MW）/（ε×I）]×DF×100 （4）

式中，Amax：最大吸收波长处的吸光度值；C：样品中花色苷含量（mg/100mL）；MW：矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2mg/mol）；DF：总稀释倍数；ε：矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数（26 900L/mol?cm）；I：比色杯光程（cm）。

同一样品平行测定6次，计算出花色苷含量。精密度计算同2.4.1。

3 结果与分析

3.1 消光系数法

3.1.1 最大吸收波长的确定 从图1可知，直接用酸化乙醇稀释的蓝莓米酒花色苷溶液中，在546nm处有一最大吸收峰，这是花色苷的特征峰。

3.1.2 精密度试验 表1显示，在酸化乙醇溶液中，通过对花色苷吸光度值的6次平行测定，计算得出蓝莓米酒原液中花色苷含量为16.82（±0.36）mg/100mL，相对标准偏差（RSD）为1.22%。

3.2 pH示差法

3.2.1 最大吸收波长的确定 比较图2、图3可知，在pH1.0的盐酸-氯化钾缓冲液中，蓝莓米酒在526nm左右处有一最大吸收峰。该吸收峰在pH1.0的盐酸-氯化钾缓冲液和pH4.5的盐酸-醋酸钠缓冲液中差值最大。考虑到仪器的波动，确定在最大吸收值526nm和700nm处读数。

3.2.2 精密度试验 从表2可知，在所选定的pH值分别为1.0和4.5的缓冲液中，通过对花色苷吸光度值的6次平行测定，计算得到蓝莓米酒原液中花色苷含量为17.48（±0.40）mg/100mL，相对标准偏差（RSD）为1.41%。

4 结论

采用消光系数法和pH示差法测定自制蓝莓米酒总花色苷含量，分别为16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2种方法均较为准确地反映了样品在溶液体系中的浓度，但pH示差法操作难度明显大于消光系数法，因此建议相关产品研发时可选用较为简便的消光系数法，最终产品选用较为准确的pH示差法。

参考文献

[1]钱慧碧，辛秀兰，张东升，等.溶剂提取蓝莓果渣中总黄酮的研究[J].食品工业科技，2010，31（11）：272-274.

[2]宋德群，孟宪军，王晨阳，等.蓝莓花色苷的pH 示差法测定[J].沈阳农业大学学报，2013，43（2）：231-233.

[3]魏国华，吕良伟，邵斌，等.越橘提取物的研究进展[J].中国食品添加剂，2011（4）：139-143.

[4]陈介甫，李亚东，徐哲.蓝莓的主要化学成分及生物活性[J].药学学报，2010，45（4）：422?429.

[5]李颖畅，孟宪军，孙靖靖，等.蓝莓花色苷的降血脂和抗氧化作用[J].食品与发酵工业，2008（10）：44-48.

[6]曹少谦，潘思轶.血橙花色苷研究进展[J].食品科学，2006，09（27）：278-282.

[7]孙婧超，刘玉田，赵玉平，等.pH示差法测定蓝莓酒中花色苷条件的优化[J].中国酿造，2011（11）：171-174.

[8]闫亚美，冉林武，曹有龙，等.黑果枸杞花色苷含量测定方法研究[J].食品工业，2012，33（6）：145-147.

[9]王秀菊.蓝莓干酒及蓝莓酒渣花色苷提取工艺的研究[D].泰安：山东农业大学，2010. （责编：施婷婷）endprint

A=（Amax-A700）pH1.0-（Amax-A700）pH4.5 （3）

C（mg/100mL）=[（A×MW）/（ε×I）]×DF×100 （4）

式中，Amax：最大吸收波长处的吸光度值；C：样品中花色苷含量（mg/100mL）；MW：矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2mg/mol）；DF：总稀释倍数；ε：矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数（26 900L/mol?cm）；I：比色杯光程（cm）。

同一样品平行测定6次，计算出花色苷含量。精密度计算同2.4.1。

3 结果与分析

3.1 消光系数法

3.1.1 最大吸收波长的确定 从图1可知，直接用酸化乙醇稀释的蓝莓米酒花色苷溶液中，在546nm处有一最大吸收峰，这是花色苷的特征峰。

3.1.2 精密度试验 表1显示，在酸化乙醇溶液中，通过对花色苷吸光度值的6次平行测定，计算得出蓝莓米酒原液中花色苷含量为16.82（±0.36）mg/100mL，相对标准偏差（RSD）为1.22%。

3.2 pH示差法

3.2.1 最大吸收波长的确定 比较图2、图3可知，在pH1.0的盐酸-氯化钾缓冲液中，蓝莓米酒在526nm左右处有一最大吸收峰。该吸收峰在pH1.0的盐酸-氯化钾缓冲液和pH4.5的盐酸-醋酸钠缓冲液中差值最大。考虑到仪器的波动，确定在最大吸收值526nm和700nm处读数。

3.2.2 精密度试验 从表2可知，在所选定的pH值分别为1.0和4.5的缓冲液中，通过对花色苷吸光度值的6次平行测定，计算得到蓝莓米酒原液中花色苷含量为17.48（±0.40）mg/100mL，相对标准偏差（RSD）为1.41%。

4 结论

采用消光系数法和pH示差法测定自制蓝莓米酒总花色苷含量，分别为16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2种方法均较为准确地反映了样品在溶液体系中的浓度，但pH示差法操作难度明显大于消光系数法，因此建议相关产品研发时可选用较为简便的消光系数法，最终产品选用较为准确的pH示差法。

参考文献

[1]钱慧碧，辛秀兰，张东升，等.溶剂提取蓝莓果渣中总黄酮的研究[J].食品工业科技，2010，31（11）：272-274.

[2]宋德群，孟宪军，王晨阳，等.蓝莓花色苷的pH 示差法测定[J].沈阳农业大学学报，2013，43（2）：231-233.

[3]魏国华，吕良伟，邵斌，等.越橘提取物的研究进展[J].中国食品添加剂，2011（4）：139-143.

[4]陈介甫，李亚东，徐哲.蓝莓的主要化学成分及生物活性[J].药学学报，2010，45（4）：422?429.

[5]李颖畅，孟宪军，孙靖靖，等.蓝莓花色苷的降血脂和抗氧化作用[J].食品与发酵工业，2008（10）：44-48.

[6]曹少谦，潘思轶.血橙花色苷研究进展[J].食品科学，2006，09（27）：278-282.

[7]孙婧超，刘玉田，赵玉平，等.pH示差法测定蓝莓酒中花色苷条件的优化[J].中国酿造，2011（11）：171-174.

[8]闫亚美，冉林武，曹有龙，等.黑果枸杞花色苷含量测定方法研究[J].食品工业，2012，33（6）：145-147.

[9]王秀菊.蓝莓干酒及蓝莓酒渣花色苷提取工艺的研究[D].泰安：山东农业大学，2010. （责编：施婷婷）endprint

A=（Amax-A700）pH1.0-（Amax-A700）pH4.5 （3）

C（mg/100mL）=[（A×MW）/（ε×I）]×DF×100 （4）

式中，Amax：最大吸收波长处的吸光度值；C：样品中花色苷含量（mg/100mL）；MW：矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2mg/mol）；DF：总稀释倍数；ε：矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数（26 900L/mol?cm）；I：比色杯光程（cm）。

同一样品平行测定6次，计算出花色苷含量。精密度计算同2.4.1。

3 结果与分析

3.1 消光系数法

3.1.1 最大吸收波长的确定 从图1可知，直接用酸化乙醇稀释的蓝莓米酒花色苷溶液中，在546nm处有一最大吸收峰，这是花色苷的特征峰。

3.1.2 精密度试验 表1显示，在酸化乙醇溶液中，通过对花色苷吸光度值的6次平行测定，计算得出蓝莓米酒原液中花色苷含量为16.82（±0.36）mg/100mL，相对标准偏差（RSD）为1.22%。

3.2 pH示差法

3.2.1 最大吸收波长的确定 比较图2、图3可知，在pH1.0的盐酸-氯化钾缓冲液中，蓝莓米酒在526nm左右处有一最大吸收峰。该吸收峰在pH1.0的盐酸-氯化钾缓冲液和pH4.5的盐酸-醋酸钠缓冲液中差值最大。考虑到仪器的波动，确定在最大吸收值526nm和700nm处读数。

3.2.2 精密度试验 从表2可知，在所选定的pH值分别为1.0和4.5的缓冲液中，通过对花色苷吸光度值的6次平行测定，计算得到蓝莓米酒原液中花色苷含量为17.48（±0.40）mg/100mL，相对标准偏差（RSD）为1.41%。

4 结论

采用消光系数法和pH示差法测定自制蓝莓米酒总花色苷含量，分别为16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2种方法均较为准确地反映了样品在溶液体系中的浓度，但pH示差法操作难度明显大于消光系数法，因此建议相关产品研发时可选用较为简便的消光系数法，最终产品选用较为准确的pH示差法。

参考文献

[1]钱慧碧，辛秀兰，张东升，等.溶剂提取蓝莓果渣中总黄酮的研究[J].食品工业科技，2010，31（11）：272-274.

[2]宋德群，孟宪军，王晨阳，等.蓝莓花色苷的pH 示差法测定[J].沈阳农业大学学报，2013，43（2）：231-233.

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[4]陈介甫，李亚东，徐哲.蓝莓的主要化学成分及生物活性[J].药学学报，2010，45（4）：422?429.

[5]李颖畅，孟宪军，孙靖靖，等.蓝莓花色苷的降血脂和抗氧化作用[J].食品与发酵工业，2008（10）：44-48.

[6]曹少谦，潘思轶.血橙花色苷研究进展[J].食品科学，2006，09（27）：278-282.

[7]孙婧超，刘玉田，赵玉平，等.pH示差法测定蓝莓酒中花色苷条件的优化[J].中国酿造，2011（11）：171-174.

[8]闫亚美，冉林武，曹有龙，等.黑果枸杞花色苷含量测定方法研究[J].食品工业，2012，33（6）：145-147.

[9]王秀菊.蓝莓干酒及蓝莓酒渣花色苷提取工艺的研究[D].泰安：山东农业大学，2010. （责编：施婷婷）endprint