基于Diurnal在线软件分析拟南芥生物节律基因对GABA的响应

向文豪等

摘 要：Diurnal是一个基于网络的在线分析工具，利用该工具可以得到几种模式植物基因组范围内的昼夜和生物钟节律基因表达的变化规律。这一在线分析软件是一个可供搜索的数据库，它提供了几个基于网络的界面友好的数据挖掘工具，其结果以一种易于理解的方式呈现。在该研究中首先介绍了这个在线软件的使用方法，然后分析了几个拟南芥生物钟节律基因和开花基因在长日照条件下的表达模型，这些结果可以以图形和数字的方式下载用于后续的特定研究。结合在线数据，该研究表明，γ-氨基丁酸（GABA在1.0mmol/L）可以改变3个生物钟核心节律基因（TOC1，CCA1和LHY）的表达模式，这种模式的改变主要是增加了这些基因表达的幅度。

关键词：Diurnal软件；生物钟；基因表达；γ-氨基丁酸；拟南芥

中图分类号 Q94 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）08-24-05

Abstract：Diurnal is a web-based tool for accessing the diurnal and circadian genome-wide expression results of genes from several array experiments conducted on common model plants. The database is searchable and provides access to several user-friendly Web-based data-mining tools with easy-to-understand output. Here we first introduced the method of this online software application and analyzed the model pattern of some circadian clock gene components in the longday growth condition in Arabidopsis. These results can be accessed both graphically and numerically downloaded for further use in a specific study. Combining with the wet-lab experiment，we showed that application of γ-aminobutyric acid（GABA at 1.0 mmol/L）can change the pattern of the 3 core circadian clock gene（TOC1，CCA1 and LHY），mainly increasing the amplitude of the gene expression.

Key words：Diurnal online software；Circadian clock；Gene expression；γ-aminobutyric acid；Arabidopsis

地球的自转导致了大约24h光暗和温度的节律性变化。生物在进化过程为适应这一自然环境而进化了一种机制使得自身的生命周期与环境变化周期相一致。因此很多生物体学会了“记忆”时间的轨迹从而更好地利用环境。目前研究人员普遍认为生物体对于时间的“记忆”和使自身生命活动与环境同步的功能是通过内在的生物钟来实现的，生物钟使得生物的细胞活动在24h内产生节律性地变化。因此，一般认为，生物钟是一种将环境信号翻译成体内的信号使新陈代谢和生理机能发生节律性变化的一种机制。植物的生理和代谢途径、节律性生长以及营养生长向生殖生长的转换都受到生物钟的控制。研究表明，拟南芥中大约12%的基因受控于生物钟的控制在持续光照下表现出节律性的变化；考虑到各种变化的环境因素，节律性变化的基因比例有可能增加到89%左右[1-2]。这些节律性变化的基因主要受到3个关键的生物钟核心元件基因即TIMING OF CAB1（TOC1），CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 （CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）的调节[3]。

基因表达的日变化规律（Diurnal）软件（http：//diurnal.cgrb.oregonstate.edu/）提供了一个简易的可视化图形界面，用于检索和查看某一基因在昼夜变化中的基因表达变化规律。支撑这一软件运行的数据主要来自于拟南芥、杨树和水稻等基因芯片平台提供的数据库在图形界面，用户可以输入感兴趣的基因编码或一系列的基因编号（gene identifier），并选择相应的实验条件（如长日照、短日照以及是否有温度的昼夜变化等），研究者就可以查看到这一基因在设定的环境条件下的表达模式，并将这种模式以直观的图形界面呈现，图片可以以几种不同的格式（如BMP、JEPG、TNG等）进行存储，用于后续的研究。

γ-氨基丁酸（GABA）在植物的发育中起着重要的作用[4-6]。为探讨外源性GABA是否参与了拟南芥生物钟的调节，本研究在实验中设置了生物钟节律研究的Zeitgeber time（ZT）时间，借助于Diurnal在线分析软件探讨了GABA对生物钟节律基因表达模式的规律。

1 材料和方法

1.1 材料 将Col野生型拟南芥种子种在蛭石上，春化处理后放入温室培养，22℃，16h光照，8h黑暗（光照时间从早上07∶00开始到晚上23∶00结束）。对7d日龄的幼苗隔天人工分别喷洒清水和1.0mmol/L的GABA，培养3周后进行48h持续光照，从最后一个昼夜循环起开始每4 取材料，直到48h的持续光照时间结束，共取材料3d，取18次，并且将第一次取材时间设为生物钟节律研究的Zeitgeber time （ZT）的0h，本实验中ZT0是从上午11∶00开始的，取好的材料迅速放入液氮中，保存在-70℃冰箱备用。endprint

1.2 Real-time PCR分析 取80mg莲座叶片或花序组织采用AxyPrep总RNA小量制备试剂盒（Axygen）提取RNA。取1μg RNA采用TOYOBO的cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA第一链，将得到的cDNA稀释5倍作为荧光定量PCR的模板。

荧光定量PCR的引物由北京擎科生物技术有限公司合成，扩增片段大小在100～300bp。PCR仪为ABI-7500 Fast，荧光染料为罗氏FastStart Universal SYBR Green Master。20μL反应体系：FastStart Universal SYBR Green Master 10μL，正向引物（25μmol/L） 0.5μL，反向引物（25μmol/L）0.5μL，ddH2O 7μL，cDNA 2μL。采用两步法进行反应，反应程序为：预变性95℃ 10min，变性95℃ 10s，退火和延伸60℃ 30s，40个循环。以PP2AA3为内参基因，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。实验所用引物序列如下：PP2AA3-F：5-GCGGTTGTGGAGAACATGATACG-3；PP2AA3-R：5-GAACCAAACACAATTCGTTGCTG-3；TOC1-F：5-TCTTCGCAGAATCCCTGTGAT-3，TOC1-R：5-GCTGCACCTAGCTTCAAGCA-3；CCA1-F：5-CCTTTTACAAACACCGGCTCTT-3；CCA1-R：5-AATCGGGAGGCCAAAATGA-3；LHY-F：5-GGCATTTCCACGCAGATATT；LHY-R：5-GGAAACGCTTGATGAGAGC-3。

1.3 Diurnal软件的在线分析 Diurnal在线分析软件的网站如下：http：//diurnal.mocklerlab.org/，其使用操作见下文分析。

2 结果与分析

2.1 软件的操作需要选择植物生长模式 植物的生长条件，如蔗糖浓度、光照时间在很大程度上影响到基因的节律性表达。因此在分析基因的节律性表达时首先要确定植物的生长条件（表1）。表1显示一些最常见的拟南芥培养条件供进行研究时参考，例如，如果是长日照条件下的研究基因的节律性表达，就需要在培养条件中设定16h/8h的光暗恒温（22℃）循环，3%的蔗糖的琼脂糖培养（表1）。不同的培养条件需要做出相应的选择。

2.2 Diurnal图形界面的设计、特点和操作步骤 Diurnal的布局、字体、配色方案是一个用户友好的界面。点击http：//diurnal.mocklerlab.org/登陆在线分析软件。在这一软件的主页，含有Diurnal软件的简短介绍（图1）。此外，在网页的上方还有工具支持组件的介绍，包括该软件所整合的软件如HAYSTACK和Element等，用户可根据需要进行相应的查看和分析。进入Diurnal主页后，点击Get Started或search选项，页面显示如下界面（图1中2），该页面显示了一些基本的搜索功能，如在Genome下拉菜单中选择植物的种属名字。目前，支持在线分析的数据库来源于拟南芥、水稻、玉米、杨树、短柄草和大豆共6种作物的基因芯片数据，其中较为详尽的是拟南芥的数据资源，研究者在进行分析时应选择相应的物种。本文以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为例进行分析和研究。在实验条件栏目中，研究者应在相应的实验条件中打勾，如长日照（图1中3），然后再进行后续的操作分析。有些植物的培养条件是在某一条件如持续光照条件（LL）下转变为另一条件如持续光照的温度循环（LDHC），其条件就表示为图1中3。其它培养条件的具体意义请参考网站的详细介绍，以便做出正确的选择和参考。

2.3 Dinurnal操作的主要要点 在图1中3的Identifiers文本框中，输入需要搜索的基因编号，如At5G61380（下文中的TOC1基因），确定是否需要更改基因表达的cutoff值，系统默认的cutoff值为0.8，当然用户也可以根据自己的需要来更改这个数值。然后确定是否需要选择Display Models，然后点击Submit。显示的结果包含有2条曲线的图型和一个表格（图2），表格总结了实验条件、时相和拟合最好的基因节律性变化的模式（图2）。如果在Display models选项中选择不做选择（不打勾），实验的结果将是一条曲线和相应的表格。图2中，折线图显示了一个基因在长日照条件下随时间变化的曲线，图中的数据是基于基因芯片的相对表达量的分析。此外，数据的展示还以HAYSTACK组件进行了模型匹配算法（pattern-matching algorithm）的模拟，得出了该基因表达变化的最佳模型。需要指出的是，实时基因的表达值可以通过鼠标的点击进行查看，此值一般在折线的拐点处显示。在表格中相位变化的拐点是表达量达到最大值的时刻，图2中的Rigid表示的是曲线的类型（图2）。

2.4 基因昼夜节律表达的6种基本的模型 通过HAYSTACK组件的模拟分析，基因的表达模式除Rigid曲线类型外，还有Spike（尖刺状）、Sine（正弦状）、Cosine（余弦状）、box1和box2类型的曲线（图3）。所有节律性基因表达的模式经过Haystack算法模拟后会适合其中一个模式，显示了这些基因在昼夜循环过程中基因表达的规律。

2.5 生物钟核心元件基因表达模式分析 为使结果呈现的比较美观，有时可以把数据拷贝到excel表格中重新做图（图4），但其图形的类型不变。对于每一个基因来说，实验条件的不同，其基因表达的昼夜节律呈现不同的曲线类型。

生物钟节律性基因调节的组件中，假式响应调节蛋白（Pseudo-Response Regulator，PRR） 基因随昼夜时间的进程依次表达[7]，其先后表达顺序为PRR9、PRR7和PRR3，这些基因的表达模式都为Spike模型（图4A）；在长日照条件下，GIGANTEA（GI）参与了拟南芥的开花诱导，在转录水平上，GI也可以以一种不依赖于光周期的途径诱导CONSTANS（CO）的转录[8]，而CO是控制开花的一个关键因子[9]。LUX（LUX ARRHYTHMO，也称为PHYTOCLOCK 1）是一个含单一MYB结构域SHAQYF的转录因子，它可以和EARLY FLOWERING 3（ELF3）和EARLY FLOWERING 4（ELF4）形成复合体来控制下胚轴的节律性生长[10]。分析显示，在长日照条件下，GI的表达模式为Spike模型，而Lux的表达模式正弦模式（图4B），CO的表达模式为余弦模式（图4C）；CCR2（cold，circadian rhythm，and RNA binding 2）是一个富含甘氨基酸的RNA结合蛋白，它可以反馈调节生物钟节律振荡和其自身的基因表达。其表达受到冷胁迫的诱导[11]。分析表明，在长日照条件下CCR2的表达为box模式（图4D）。其它的基因表达模式在此不做一一介绍。endprint

2.6 GABA参与的生物钟节律的基因表达分析 在课题研究中，我们以长日照条件培养拟南芥。以培养基中添加GABA作为处理，每4h进行样品的采集。以荧光定量PCR进行基因表达的定量分析，根据RT-PCR计算的倍率变化，将数据统计在excel表格中，以在线分析的图形数据为参照，计算GABA处理后的表达变化，然后作图与对照进行比较，可以归纳出GABA对生物钟调控的规律。TIMING OF CAB1（TOC1），CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL （LHY）编码的转录因子是生物钟节律中3个重要的核心元件，它们交互调节生物节律的功能输出[12-13]。在长日照条件下3个生物钟核心元件基因的表达模式为Rigid模型（图5中的实线部分）。在外施GABA（1.0 mmol/L）条件下，与对照相相比，生物钟3个核心元件基因的表达模式发生了明显变化，基因表达的幅度明显高于对照（图5中的虚线部分）。

3 讨论

以网络为依托的含有基因表达数据的数据库和基因芯片的分析工具为植物学研究提供了许多宝贵的资源。其中，Diurnal软件工具包含了将近228 000个拟南芥昼夜节律和生物钟节律的基因表达。这些结果来自于Michael、Mockler和Breton等人对拟南芥11个2d时间（大约12点时间点）进程的132个基因芯片（Affymetrix microarrays）的数据比较，用HAYSTACK组件的336个模型对这些基因的表达进行拟合。这一网络资源提供了一个可供搜索的图形界面，同时也可以对基因的启动子元件进行分析。研究表明，生物钟核心元件的基因表达规律极易受到周围环境的影响[14]，如植物生长过程中培养中添加蔗糖可以改变生物钟节律表达的模式[15]。目前的数据证明了GABA的使用可以重新设置生物钟的振荡频率，这也许是导致GABA处理后植物表型变化的本质所在，这一有趣的工作尚需深入进行研究。

参考文献

[1]Mockler TC，Michael TP，Priest HD，et al. The DIURNAL project： DIURNAL and circadian expression profiling，model-based pattern matching，and promoter analysis[J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2007，72：353-363.

[2]Michael TP，Mockler TC，Breton G，et al. Network discovery pipeline elucidates conserved time-of-day-specific cis-regulatory modules[J]. PLoS Genet，2008，4（2）：14.

[3]Nagel DH，Kay SA. Complexity in the wiring and regulation of plant circadian networks. Curr Biol，2012，22（16）：648-657.

[4]Liu CL，Zhao L，Yu GH. The dominant glutamic acid metabolic influx to produce γ-amino butyric acid over proline in Nicotiana tabacum leaves under water stress relates to its significant role of antioxidant activity Integr[J]. Plant Biol，2011，53： 608-618.

[5]赵 丽，赵志龙，龚汉雨，等. GABA对烟草花粉管Ca2+和K+的动态调节表明离子通道参与了花粉管生长的调控[J].中国细胞生物学报，2013，32（5）：668-675.

[6]张瑞琦，赵丽，覃永华，等. γ-氨基丁酸促进拟南芥开花的机理研究[J].中国农学通报，2012，28（15）： 142-147.

[7]Adams S，Carré IA. Downstream of the plant circadian clock：output pathways for the control of physiology and development[J]. Essays Biochem ，2011，49（1）： 53-69.

[8]Sawa M，Kay SA. GIGANTEA directly activates flowering locus T in Arabidopsis thaliana[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011；108（28）： 11 698-11 703.

[9]Song YH，Smith RW，To BJ，et al. FKF1 conveys timing information for CONSTANS stabilization in photoperiodic flowering[J]. Science，2012，336（6084）： 1 045-1 049.

[10]Nusinow DA，Helfer A，Hamilton EE，et al. The ELF4-ELF3-LUX complex links the circadian clock to diurnal control of hypocotyl growth[J]. Nature ，2011，475（7356）： 398-402.

[11]Jarillo JA，Capel J，Tang RH，et al. An Arabidopsis circadian clock component interacts with both CRY1 and phyB[J]. Nature ，2001，410（6827）：487-490.

[12]Pruneda-Paz JL，Kay SA. An expanding universe of circadian networks in higher plants[J]. Trends Plant Sci ，2010，15（5）： 259-265.

[13]Lau OS，Huang X，Charron JB，et al. Interaction of Arabidopsis DET1 with CCA1 and LHY in mediating transcriptional repression in the plant circadian clock[J]. Mol Cell ，2011，43（5）： 703-712.

[14]Andrés F，Coupland G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues[J]. Nat Rev Genet，2012，13（9）：627-39.

[15]Haydon MJ，Mielczarek O，Robertson FC，et al. Photosynthetic entrainment of the Arabidopsis thaliana circadian clock[J]. Nature ，2013，502（7473）：689-692. （责编：施婷婷）endprint

2.6 GABA参与的生物钟节律的基因表达分析 在课题研究中，我们以长日照条件培养拟南芥。以培养基中添加GABA作为处理，每4h进行样品的采集。以荧光定量PCR进行基因表达的定量分析，根据RT-PCR计算的倍率变化，将数据统计在excel表格中，以在线分析的图形数据为参照，计算GABA处理后的表达变化，然后作图与对照进行比较，可以归纳出GABA对生物钟调控的规律。TIMING OF CAB1（TOC1），CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL （LHY）编码的转录因子是生物钟节律中3个重要的核心元件，它们交互调节生物节律的功能输出[12-13]。在长日照条件下3个生物钟核心元件基因的表达模式为Rigid模型（图5中的实线部分）。在外施GABA（1.0 mmol/L）条件下，与对照相相比，生物钟3个核心元件基因的表达模式发生了明显变化，基因表达的幅度明显高于对照（图5中的虚线部分）。

3 讨论

以网络为依托的含有基因表达数据的数据库和基因芯片的分析工具为植物学研究提供了许多宝贵的资源。其中，Diurnal软件工具包含了将近228 000个拟南芥昼夜节律和生物钟节律的基因表达。这些结果来自于Michael、Mockler和Breton等人对拟南芥11个2d时间（大约12点时间点）进程的132个基因芯片（Affymetrix microarrays）的数据比较，用HAYSTACK组件的336个模型对这些基因的表达进行拟合。这一网络资源提供了一个可供搜索的图形界面，同时也可以对基因的启动子元件进行分析。研究表明，生物钟核心元件的基因表达规律极易受到周围环境的影响[14]，如植物生长过程中培养中添加蔗糖可以改变生物钟节律表达的模式[15]。目前的数据证明了GABA的使用可以重新设置生物钟的振荡频率，这也许是导致GABA处理后植物表型变化的本质所在，这一有趣的工作尚需深入进行研究。

参考文献

[1]Mockler TC，Michael TP，Priest HD，et al. The DIURNAL project： DIURNAL and circadian expression profiling，model-based pattern matching，and promoter analysis[J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2007，72：353-363.

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[14]Andrés F，Coupland G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues[J]. Nat Rev Genet，2012，13（9）：627-39.

[15]Haydon MJ，Mielczarek O，Robertson FC，et al. Photosynthetic entrainment of the Arabidopsis thaliana circadian clock[J]. Nature ，2013，502（7473）：689-692. （责编：施婷婷）endprint

2.6 GABA参与的生物钟节律的基因表达分析 在课题研究中，我们以长日照条件培养拟南芥。以培养基中添加GABA作为处理，每4h进行样品的采集。以荧光定量PCR进行基因表达的定量分析，根据RT-PCR计算的倍率变化，将数据统计在excel表格中，以在线分析的图形数据为参照，计算GABA处理后的表达变化，然后作图与对照进行比较，可以归纳出GABA对生物钟调控的规律。TIMING OF CAB1（TOC1），CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL （LHY）编码的转录因子是生物钟节律中3个重要的核心元件，它们交互调节生物节律的功能输出[12-13]。在长日照条件下3个生物钟核心元件基因的表达模式为Rigid模型（图5中的实线部分）。在外施GABA（1.0 mmol/L）条件下，与对照相相比，生物钟3个核心元件基因的表达模式发生了明显变化，基因表达的幅度明显高于对照（图5中的虚线部分）。

3 讨论

以网络为依托的含有基因表达数据的数据库和基因芯片的分析工具为植物学研究提供了许多宝贵的资源。其中，Diurnal软件工具包含了将近228 000个拟南芥昼夜节律和生物钟节律的基因表达。这些结果来自于Michael、Mockler和Breton等人对拟南芥11个2d时间（大约12点时间点）进程的132个基因芯片（Affymetrix microarrays）的数据比较，用HAYSTACK组件的336个模型对这些基因的表达进行拟合。这一网络资源提供了一个可供搜索的图形界面，同时也可以对基因的启动子元件进行分析。研究表明，生物钟核心元件的基因表达规律极易受到周围环境的影响[14]，如植物生长过程中培养中添加蔗糖可以改变生物钟节律表达的模式[15]。目前的数据证明了GABA的使用可以重新设置生物钟的振荡频率，这也许是导致GABA处理后植物表型变化的本质所在，这一有趣的工作尚需深入进行研究。

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[11]Jarillo JA，Capel J，Tang RH，et al. An Arabidopsis circadian clock component interacts with both CRY1 and phyB[J]. Nature ，2001，410（6827）：487-490.

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[15]Haydon MJ，Mielczarek O，Robertson FC，et al. Photosynthetic entrainment of the Arabidopsis thaliana circadian clock[J]. Nature ，2013，502（7473）：689-692. （责编：施婷婷）endprint