试验用和临床用紫杉醇诱导肝癌细胞凋亡的比较

摘要

[目的]为了探讨试验用和临床用紫杉醇对肝癌HepG2 细胞凋亡诱导作用的差异。[方法]用不同浓度的试验用和临床用紫杉醇处理肝癌HepG2培养细胞后，通过显微观察和流式细胞术检测其细胞凋亡。[结果]临床用紫杉醇在终浓度为0.5、1.0和2.0 mg/ml时，24 h非常显著性诱导细胞凋亡，48 h诱导细胞凋亡更剧烈。试验用紫杉醇24 h在终浓度为2.5、5.0和10.0 mg/ml时，非常显著诱导细胞凋亡；当试验用紫杉醇浓度为2.5 mg/ml时，48 h诱导细胞凋亡更剧烈。当试验用紫杉醇浓度为5和10 mg/ml细胞凋亡率逐步变低，可能走向死亡。[结论]在诱导肝癌细胞凋亡中，试验用紫杉醇要比临床所用紫杉醇的浓度要高。

关键词紫杉醇；肝癌细胞HepG2 ；细胞凋亡；流式细胞术

中图分类号S857.1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01711-03

Abstract[Objective] In order to explore the difference of experimental or clinically used paclitaxel in inducing hepatoma HepG2 cell apoptosis. [Method] The cells were cultured in PRMI1640 medium and treated with experimental or clinically used paclitaxel in the different concentrations. The apoptosis in the cells was detected with the light microscope and the flow cytometry. [Result] With the treatment of the clinical used paclitaxel in the final concentration of 0.5， 1.0， 2.0 mg/ml， the apoptosis can be induced very significantly in 24 hours， the cell apoptosis induced by 48 hours more intense. With experimental paclitaxel for 24 hours at a final concentration of 2.5， 5.0， 10.0 mg/ml， the apoptosis can be induced very significantly in 24 hours； 2.5 mg/ml， apoptosis induced more intense by 48 hours. With the experimental paclitaxel concentration is 5.0， 10.0 mg/ml， the rate of cell apoptosis gradually becomes low， the cells may lead to death. [Conclusion] The concentration of experimental paclitaxel is higher than the clinically used paclitaxel in inducing hepatoma cell apoptosis.

Key words Paclitaxel； Human hepotoma cell line HepG； Apoptosis； Flow cytometry

紫杉醇是一種天然的抗癌新药，从红杉属植物紫杉的树皮和树干中提取，具有独特的结构和作用机制，可以阻抑细胞周期于G2/M期并诱导细胞凋亡[1]。 但是，试验用和临床用紫杉醇诱导肝癌细胞凋亡的差异鲜有报道。为此，笔者对试验用和临床用紫杉醇诱导肝癌细胞凋亡进行了比较研究。

1材料与方法

1.1细胞培养、药物及处理

肝癌细胞系HepG2由中国医学科学院提供，用含10%小牛血清的PRMI1640培养基接种细胞，置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养24 h。然后，换成含0.5、1.0、2.0 mg/ml终浓度临床用紫杉醇的培养基继续培养24和48 h。试验用紫杉醇的浓度由低到高直到出现明显凋亡现象。临床用紫杉醇注射液（Paclitaxel injection），批号为12121111，主要成分为紫杉醇。辅料为纯化聚氧乙烯基蓖麻油35、无水乙醇，均由扬子江药业集团有限公司生产。试验用紫杉醇（Paclitaxel），批号为A0177 （DMSO溶解后以细胞培养基稀释至适宜浓度供实验用）。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 凋亡细胞的检测

1.2.1

显微观察。光学显微镜下观察细胞形态，同时进行显微照相，观察产生凋亡细胞的情况。

3讨论

传统上，通过光学显微镜观察可以检测细胞的凋亡。流式细胞术作为一种高新技术，为细胞凋亡研究提供了有效的技术手段。该技术可针对细胞在凋亡时产生的一系列形态学、生物化学及分子生物学性质的变化，胞质Ca2+浓度升高，DNA片段化及含量变化等特点，进行定性、定量分析，从而实现对细胞凋亡的准确测定[1]。紫杉醇（Paclitaxel）是来源于红豆杉属植物的一种二萜类化合物，是20世纪发现的一种高效广谱癌症化疗药物[2]。它是一种高效微管蛋白抑制剂，与先前发现的微管抑制剂作用靶点和机制均不同，作用于微管蛋白β亚基N端第31 位氨基酸，促进微管聚合并稳定微管结构，阻止其解聚成亚单位，进而影响微管聚合与解聚的动态平衡，阻碍纺锤丝的形成，导致细胞周期阻断于G2/M期，从而导致细胞凋亡或死亡，同时还可以改变细胞膜超微结构，从而发挥抗肿瘤作用。但由于紫杉醇的水溶性很差，只能溶于聚氧乙烯蓖麻油或乙醇等有机溶剂中。因此，最广泛的临床制剂为紫杉醇注射剂，现临床应用的紫杉醇注射液为由聚氧乙烯蓖麻油，无水乙醇（体积比为50∶50）制成的无色黏稠状浓溶液[3-6]。微管是真核细胞的一种组成部分，其功能是构成细胞的网状支架，维持细胞形态，参与细胞的收缩伪足运动，参加细胞器的位移及胞内物质运输等，其中尤为重要的染色体的分裂和位移需要在微管的帮助下进行。正常情况下。微管和微管蛋白二聚体之间存在动态平稳。微管在钙离子的作用下解聚。有丝分裂时形成纺缍体和纺缍丝。牵引染色体向两极移动[7]。紫杉醇依赖性地、可逆地结合在微管下，诱导和促进微管蛋白的聚合，稳定微管、防止解聚。导致染色体断裂并抑制细胞复制和移行，而阻碍肿瘤细胞复制。高浓度及低浓度紫杉醇抑制细胞有丝分裂和增生的作用机制并不完全相同， 在高浓度（血清浓度0.45 μmol/L）下增加微管二聚体的数量和聚合速度， 促进微管束的形成； 在低浓度（<10 nmol/L）下抑制胞质微管的解聚， 增加其动力学稳定性。临床应用的主要是紫杉醇注射液， 即由乳浮EL （Cremophor EL， 含聚氧乙烯蓖麻油）/无水乙醇（50∶50）制成的无色黏稠状浓溶液， 使用时用5%右旋糖酐或生理盐水稀释成0.3～1.2 g/L溶液后静脉滴注3～24 h，输注剂量为135～ 175 mg/ml，最大耐受剂量（MTD） 为3 h内输注225～ 240 mg/ml[8]。

笔者通过显微观察发现以含0.5、10和20 mg/ml临床用紫杉醇的培养基处理肝癌细胞HepG2，24 h后见到细胞形态非常明显变化的发生，许多细胞变圆，细胞质和染色质浓缩，细胞膜弯曲，呈小泡状；细胞核碎裂形成典型的凋亡小体。紫杉醇处理肝癌细胞48 h后，细胞凋亡细胞数进一步增多，正常细胞数减少，细胞脱落而悬浮于培养基中；少数细胞体积增大、膜破裂而呈细胞坏死状。试验用紫杉醇的浓度十几到几十倍浓度时，细胞才能出现以上状况。这可能是由于试验用的紫杉醇没有充分溶解所致。临床用紫杉醇中含有助溶剂使其充分溶解，其诱导细胞凋亡的作用得以充分发挥。笔者通过流式细胞术分析发现，临床用紫杉醇在终浓度为0.5、10和20 mg/ml时，24 h就可显著诱导细胞凋亡。试验用紫杉醇在24 h终浓度为2.5、50、100 mg/ml时，才可非常显著地诱导细胞凋亡。48 h，试验用紫杉醇在终浓度为25 mg/ml时诱导细胞凋亡更剧烈，凋亡细胞比率更高；当试验用紫杉醇终浓度为5 mg/ml细胞凋亡率变低，但和对照相比较仍有显著性差异 ；10 mg/ml细胞凋亡率更低，并且与对照没有显著性差异。这说明试验用紫杉醇需要高浓度时才能诱导细胞凋亡。但是，随着浓度的增高和时间的延长，凋亡细胞逐渐变少，可能更多细胞走向死亡的结果。

为了解决紫杉醇的溶解性等问题，更好地进行临床用药，已经开展了许多研究。有人利用聚乳酸聚乙醇酸共聚物（Poly lactide—co—glycolic acid，PLGA）纳米粒作为紫杉醇的载体，力求发现一种简单高效的新型紫杉醇载药体，他们研制载紫杉醇聚乳酸聚乙醇酸共聚物纳米粒，载紫杉醇聚乳酸聚乙醇酸共聚物纳米粒子可明显诱导细胞凋亡，且有明显的量效和时效关系，质量浓度越高、时间越长效果越明显[2]。利用纳米技术可使紫杉醇与白蛋白纳米粒子结合，除了可以减轻有机溶剂对肾和神经组织的毒性即降低有机溶剂所致超敏反应发生率外，白蛋白受体还可以提高药物向肿瘤细胞的靶向输送[3]。解决这个问题主要有2种途径[4]：①在其化学结构上进行修饰，增加其水溶性。由于紫杉醇极微小的结构变化都会对其与微管蛋白的结合活性有较大影响，因而修饰时必须慎重。②采用脂质体剂型，以脂质体为载体，将紫杉醇包封于其中，使水不溶性的紫杉醇易溶于生理盐水或5%葡萄糖注射液。这不仅便于临床用药，更重要的是避免了因使用Cremophor EL而引起的过敏反应。脂质体属于超微粒药物载体，具有淋巴系统定性，可以通过内吞作用进入溶酶体，然后被酶消化而放出药物也可以通过细胞融合作用，即脂质体膜材料与细胞膜构成物相似，而融合進入细胞内，被消化后释放药物，使药物在靶区组织中维持较高浓度，以提高抗癌药物的生物利用度。最近Tatebe等发现紫杉醇能导致细胞凋亡 ；KavalIaris等报道紫杉醇抑制卵巢上皮肿瘤与改变特定 β—tubulin基因的表达有关；Vater等通过电镜和扫描显微镜发现任Ca2+和紫杉醇存在下，微管蛋白的聚合发生畸变而且这种畸变结构随着加入紫杉醇和Ca2+的顺序不同而有所不同。改善其水溶性的最常用方法是制备其衍生物：侧链C-2位羟基酯化在体外试验活性较差。体内试验表明对活性影响不大，说明酯化产物在体内水解成羟基，封闭该位使活性丧失，因此C-2 的酯化是寻找前药的有效途径。修饰原则为：功能基在活化条件下应能自行从结合物下脱落，产生紫杉醇；新引入的基团能增加该化合物的水溶性[7]。紫杉醇药物释放支架和白蛋白纳米粒注射液相继被FDA 批准上市，是紫杉醇制剂研究的成功例证。国内外尚有乳剂、纳米粒、脂质体和聚合胶束（Genexol）等制剂进入临床试验，有希望成为下一代临床药物。紫杉醇未来制剂的研发重点将集中在紫杉醇局部或靶向缓控释制剂。同时由于制剂技术的改进，紫杉醇口服给药将获得突破[8]。

42卷6期单长民等试验用和临床用紫杉醇诱导肝癌细胞凋亡的比较

近期有人开发了一种携带紫杉醇（PTX）的胶束，由简单的共轭于聚乙二醇5000配方（PEG5K）和恩贝酸（EB）而成。恩贝酸是一种天然产物，通过阻断活性X连锁凋亡蛋白抑制剂（XIAP）具有抗肿瘤活性。PEG5K-EB2共轭自组装形成稳定的在水溶液中的胶束并有效封装疏水性药物紫杉醇。体外细胞摄取研究表明PEG5K-EB2胶束被肿瘤细胞有效吸收。体外释放研究表明PTX存在于PEG5K-EB2胶束中。PTX慢慢释放超过5 d，比紫杉醇制剂的释放慢得多。在几个培养的肿瘤细胞系中形成PEG5K-EB2胶束的 PTX比单独紫杉醇形式表现出更强的细胞毒性。近红外荧光（NIRF）成像整体上PEG5K-EB2胶束有选择性地富集在主要器官的肿瘤部位，包括肝脏和脾。PEG5K-EB2胶束中PTX表现出良好的安全性与最大耐受剂量，20～100 mg PTX/kg的小鼠，显著高于紫杉醇（15～20 mg PTX/kg）。最后，与在乳腺癌和前列腺癌的小鼠模型中的紫杉醇相比，制成的PEG5K-EB2胶束的PTX表现出优异的抗肿瘤活性[9]。

参考文献

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