不同食管癌细胞中PED/PEA-15表达的差异性及相关
2014-05-30尹荣江尹敏张凯
尹荣江 尹敏 张凯
【摘要】通过RT-PCR方法检测凋亡抑制因子PED/PEA-15在不同食管癌细胞株中的表达差异性及意义。从而进一步研究PED/PEA-15是否可作为食管癌靶向治疗的新靶点。采用不同食管癌细胞株TE1、TE2、TE3。将细胞株经过细胞复苏、传代等步骤进行扩增，然后将 TE1、TE2、TE3三种癌细胞分别分为20个备份，分别提取其RNA。通过RT-PCR 方法检测三种癌细胞中PED/PEA-15表达的差异性。结果：凋亡抑制因子PED/PEA-15在不同食管癌细胞株均有表达，但其表达无明显差异。
【关键词】凋亡抑制因子；PED/PEA-15；食管癌细胞株
食管癌在我国常见的消化道恶性肿瘤中的发病率居第四位。食管癌预后较差，五年总的生存率不足20%，严重威胁人类健康。研究表明，食管癌的发生是食管上皮细胞发生增殖性病变的过程。在食管上皮细胞发生癌变的过程中，细胞凋亡紊乱为其中重要的环节。细胞凋亡紊乱与食管癌的发生和发展有着直接性的关系，是影响食管癌发生发展的重要因素。
细胞凋亡（apoptosis）是指细胞的程序性死亡（programmed cell death，PCD），凋亡蛋白抑制因子（inhibitors of apoptosis protein，IAPs），与细胞凋亡耐受呈正相关。PED/PEA-15 与 IAPs 的抗凋亡机制相似，这种凋亡抑制蛋白首先于1998年在2型糖尿病患者中被发现。本研究通过通过 RT-PCR 方法检测凋亡抑制因子PED/PEA-15 在不同食管癌细胞株中的表达差异性。
1 材料与方法
1.1细胞培养、细胞总 RNA 的提取和 RT-PCR
1.1.1细胞培养
1.1.1.1细胞复苏：将存放细胞株TE1、TE2、TE3的细胞冻存管从-160℃冰箱内快速取出后立即放入37℃水浴箱内 2min，使其完全融化。然后在无菌操作台内向其中加入5ml含10%FBS的RPMI1640 完全培养液，放入离心机中以1000rpm离心5min。弃掉上清液，加入含10%FBS的RPMI1640完全培養液后反复吹打均匀，移入培养基内，放入5%CO2培养箱内，调至37℃静置培养，隔日更换培养液。
1.1.1.2 细胞传代：当细胞铺满培养基时就可以进行细胞传代，首先弃掉旧培养液，用PBS冲洗2次，加入胰酶消化液，轻轻摇动培养瓶，将瓶壁上的细胞全部冲洗下来，弃掉胰酶消化液，加入少量培养液反复吹打。用移液管将瓶内的细胞悬液移入离心管内，放入离心机内，以1000rpm离心5min，弃掉上清液，加入足量培养液，反复吹打后分到两个培养瓶内，然后同上所述放入培养箱内培养。
1.1.1.3 细胞冻存：在冻存细胞前24小时进行换液一次。同上所述常规进行消化、离心、弃上清液，加入冻存液（10%DMSO）1ml，用移液管反复吹打后按照 1ml/管将细胞悬液移入冻存管内。分别放入 4℃冰箱内 1h，-20℃冰箱内 2h，-80℃内过夜，最后放入-160℃冰箱内冻存。
1.1.2 组织总 RNA 的提取：
细胞经复苏、传代后，选取合适的TE1、TE2、TE3细胞株，分别将两种细胞株分为20个备份，用于提取RNA。
1.1.2.1 将细胞放入研磨器内，分别向其中加入1 ml Trizol/1 mg，然后进行反复研磨，使组织充分裂解。
1.1.2.2 分别将两组研磨液导入离心管中并做好标记，并放置冰中5min。
1.1.2.3 从冰中将两组离心管取出，并加入200μl 氯仿/1 ml Trizol，剧烈震荡15s。
1.1.2.4 取出离心管，再次放入冰中静置3min。
1.1.2.5 取出离心管放置 4℃离心机中调至12000 rpm，离心15min。
1.1.2.6 此时离心管中的液体分为3层，由上而下分别是无色液相，中间相，红色酚-氯仿层。
1.1.2.7 用无菌移液器将无色液相移入另一组离心管中，并标记好。
1.1.2.8 在两组无色液相中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀直至分层消失，放入冰中静置10min。
1.1.2.9 将两组装有无色液相的离心管放入4℃离心机中调至12000rpm，离心 10min。
1.1.2.10 取出离心管将上层清液倒掉，用75%乙醇1ml洗涤沉淀。
1.1.2.11 再次将离心管放入4℃离心机中调至7500rpm，离心5 min。
1.1.2.12 倒掉上层清液，晾干后可见管底白色沉淀。
1.1.2.13 加入1‰DEPC 蒸馏水20μl后，进行吹打混匀使其溶解，放入-80℃冰箱中保存。
1.1.3 RNA 的鉴定和定量
1.1.3.1 总 RNA 完整性的鉴定
将提取的总 RNA 与 6x 上样缓冲液按 5：1 进行混合，在 1.5%琼脂糖凝胶中以 3-5V 电压进行电泳。待上样缓冲液中的溴酚蓝迁出一定距离后，停止电泳。将凝胶移至紫外凝胶成像仪下，在 300nm 紫外光线照射下进行观察，RNA 的电泳带 28s、18s、5s 应清晰无降解。
1.1.3.2 总 RNA 纯度的鉴定和定量
将鉴定合格的总 RNA 溶解液用无菌去离子水稀释适当倍数后，在紫外分光光度仪上测 260nm 和 280 nm 两个波长的吸光度（OD260 和OD280），当 OD260/OD280在 1.7-1.8 以上，证明没有污染，方可使用。RNA含量（ug/ml）=OD260x40x 稀释倍数。
1.1.4 RT-PCR
1.1.4.1 RNA 逆转录成 cDNA
逆转录体系如下：
反应条件：将混合反应体系依次放入25℃温箱中l0min、42℃温箱中60min、99℃温箱中5min，再将其置于4℃冰箱中5min，最后将其放入-80℃冰箱中保存。
1.1.4.2 PCR 的扩增
以适量反转录所得的cDNA为模板，在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增。釆用Primer5.0软件设计PED/PEA-15基因PCR引物（产物大小为 393bp）所用PED/PEA-15引物及扩增片段序列如下：
1.1.5 PCR 扩增产物的鉴定：
将 2μl6x 上样缓冲液加入到 6μlPCR 产物中，在 1.5%琼脂糖凝胶中进
行电泳，用 100bpDNAmarker 作 DNA 分子量标准带，用 EB 进行染色，在紫外凝胶成像仪上进行观察并拍照。如出现 393bp 的电泳带，则为PED/PEA-15 阳性；同时出现 604bp 电流带，则为 GAPDH 阳性。
2 结果
根据RT-PCR实验结果进行统计学分析得出：凋亡抑制蛋白 PED/PEA-15 的 mRNA 在两种不同食管癌细胞株 TE1、TE2、TE3中表达的结果为：TE1（1.513±0.118）、TE2（1.491±0.064）、TE3（1.501±0.089）。该mRNA在两种不同癌细胞中均有表达，但表达水平无明显差异（P>0.05）。
3 讨论
食管癌是较常见的消化道恶性肿瘤之一。在我国食管癌发病率和死亡率较高，全国每年发病人数占全世界发病人数一半以上。研究表明，食管癌的发生是多种基因变化先后累积或叠加综合作用的是一个进行性的多阶段过程，是一个由多因素累积、多基因变异参与并相互作用的复杂过程。细胞凋亡（apoptosis）是由 Kerr 等人命名的，是一个由基因控制的高度有序、有一系列酶参与的主动过程。细胞凋亡紊乱直接影响肿瘤的发生和发展有，被认为是肿瘤发生发展的重要因素。由于各种抑制细胞凋亡的因素使得细胞的生存期得以延长，从而使得转化突变的细胞生长得以积累，最终导致肿瘤的发生。PED/PEA-15 是一种新近发现的具有广谱抗凋亡功能的小分子蛋白质。PED/PEA-15能使肿瘤细胞的凋亡受到抑制，对肿瘤的发生发展过程产生促进作用。
我們的实验通过RT-PCR方法，检测到PED/PEA-15基因在三种不同的食管癌细胞株中的均有表达，但表达率无明显差异，说明PED/PEA-15在不同食管癌细胞株中的表达具有普遍性。
参考文献：
[1]Ferlay J，Bray F，Pisani P，et al.Globocan 2002：Cancer Incidence，Mortali-ty and Prevalence Worldwide，Version 2.0.LARC Cancer Base No5.Lyon，IARCPress，2004
[2]乔颖，左静，刘巍.食管癌发生发展过程中的相关癌基因.临床荟萃，2009，24（4）：366-368
[3]张勤丽，牛侨等.细胞凋亡机制概述.环境与职业医学，2007，24（1）：102-107
