HPLC法测定白蜡树叶中秦皮甲素含量

孙亚伟　 孙丰润

摘要 [目的]测定白蜡树叶中秦皮甲素的含量。[方法]样品经无水甲醇回流提取，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-浓度0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V）为流动相，检测波长334 nm，柱温30 ℃，流速1.0 ml/min，采用高效液相色谱法测定含量。[结果]平均回收率为96.59%，RSD为2.39%（n=6）；白蜡树叶中秦皮甲素的平均含量为0.155 9 mg/g。[结论]该方法稳定性好，精密度高，重现性好，可用于白蜡树叶中秦皮甲素的含量测定。

关键词 秦皮甲素；白蜡树叶；HPLC；含量测定

中图分类号 O657.7；S567 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）08-02327-03

木犀科植物白蜡树（Fraxinus chinensis Roxb.）在我国分布广泛。其枝皮作为中药秦皮入药，一般采用取枝剥皮或刨树剥皮的办法获取。秦皮具有清热燥湿、收涩止痢、止带和明目的功效，主要用于治疗湿热泻痢、赤白带下、目赤肿痛和目生翳膜等症。秦皮中的主要活性成分是秦皮甲素（Aesculin）和秦皮乙素（aesculetin）。多种治疗肠炎、单纯疱疹病毒性角膜炎的中成药均以秦皮甲素含量作为质量控制指标。秦皮甲素还对试验性脂肪肝有一定的防治作用[1]；可抑制人肺癌细胞H125体外增殖，诱导细胞凋亡[2]。每年秋季有大量的白蜡树叶脱落而得不到利用，为了从自然界获取更多的药用资源，又不破坏植被，笔者对白蜡树叶中的秦皮甲素含量进行测定，以期为白蜡树叶的合理开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。白蜡树叶，于8月中旬采自山东滨州市城区，经滨州医学院孙丰润教授鉴定为白蜡树（Fraxinus chinensis Roxb.）的树叶。

1.1.2 主要仪器。Agilent 1260 HPLC仪（DAD检测器和Agilent 1260工作站），购自Agilent公司；AE240电子分析天平，购自瑞士METTLER公司；CQ250超声波清洗器，购自上海超声波仪器厂；玻璃仪器用超声波清洗器清洗1 h，用超纯水洗净后烘干备用。

1.1.3 主要试剂。秦皮甲素，购自中国药品生物制品检定所，批号：748701；秦皮乙素，购自中国药品生物制品检定所，批号：110741200506；乙腈为色谱纯，购自山东禹王实业有限公司化工分公司；甲醇为色谱纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；硅膠G薄层板，购自青岛胜海精细硅胶化工有限公司；三氯甲烷、甲酸和乙酸乙酯均为分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1 薄层层析。

1.2.1.1 对照品溶液的制备。分别取适量秦皮甲素对照品、秦皮乙素对照品，加无水甲醇制成每1.0 ml各含2.0 mg的溶液，作为对照品溶液。

1.2.1.2 供试品溶液的制备。取1.000 g干燥的白蜡树叶粉末，加乙酸乙酯10 ml，浸泡1 h，超声15 min，滤过，滤液挥干，加5 ml无水甲醇溶解，过滤，取滤液作为供试品溶液。

1.2.1.3 薄层层析。吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-无水甲醇-甲酸（6∶1∶0.5，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。

1.2.2 含量测定。

1.2.2.1 对照品溶液的制备。精密称定2.50 mg秦皮甲素，3.91 mg秦皮乙素，以无水甲醇溶解，并分别定容至50 ml的容量瓶中，备用。

1.2.2.2 样品溶液的制备。精密称取1.590 g干燥的白蜡树叶粉末（过3号筛），置具塞锥形瓶中，精密加入50 ml无水甲醇，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用无水甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.2.3 色谱分析条件。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-浓度0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V）为流动相，检测波长334 nm，柱温30 ℃，流速1.0 ml/min，进样量10 μl。

1.2.2.4 方法学考察。（1）系统适应性试验。吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，在上述色谱条件下进行测定，考察系统适应性。（2）线性关系的考察。分别精密吸取秦皮甲素对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml分别置10 ml量瓶中，用无水甲醇稀释至刻度，摇匀；分别精密吸取10 μl，注入高效液相色谱仪，以进样量X（mg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。（3）稳定性试验。精密吸取0.01 mg/ml浓度的对照品溶液各10 μl，分别于1、2、4和6 h时进样，测定峰面积积分值，计算峰面积积分值的RSD。（4）精密度试验。精密吸取0.01 mg/ml浓度的对照品溶液各10 μl，重复进样5次，计算峰面积的RSD值（5）重现性试验。按样品溶液制备方法平行制备样品溶液5份，每份取10 μl，按“样品测定”方法测定峰面积，计算RSD。（6）加样回收试验。取已知秦皮甲素含量的白蜡树叶，按“样品溶液制备”方法制备样品溶液，在无水甲醇补足减失的重量前，精密添加对照品溶液2.0 ml，混匀，精密吸取上述溶液10 μl进样，测定回收率（n=6），计算平均回收率和RSD。

1.2.2.5 样品的含量测定。取适量供试品溶液，按照“线性关系”方法，对样品进行含量测定，通过标准曲线计算白蜡树叶中秦皮甲素含量。

2 结果与分析

2.1 薄层分析 图1表明，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。白蜡树叶在秦皮乙素相应的位置上斑点不明显；以同样方法对白蜡树翅果进行试验，未检出秦皮甲素、秦皮乙素斑点。

2.2 方法学考察 （1）系统适应性试验。图2表明，供试品溶液和对照品溶液在此条件下分离效果良好。而样品溶液中秦皮乙素含量极低，因此不再进行含量测定。（2）线性关系的考察。計算得线性回归方程为：Y=1 627.50X+142.89，R为0.998 0。试验结果表明，在0.025 0～0.250 0

素浓度与峰面积的线性关系良好。（3）稳定性试验。计算得峰面积积分值的RSD为1.06%，表明指标成分在6 h内比较稳定。（4）精密度试验。计算得峰面积的RSD为1.15%，说明条件精密度良好。（5）重现性试验。计算得峰面积的RSD为1.23%，表明方法重现性良好。（6）加样回收试验。由表1可知，平均回收率为96.59%，RSD为2.39%（n=6），表明该方法准确，可靠，可用于白蜡树叶中秦皮甲素的含量测定。

2.3 样品的含量测定 由表2可知，白蜡树叶中秦皮甲素

3 结论与讨论

最新版中国药典规定，秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素的总量，不得少于1.0%[3]。而白蜡树叶中秦皮甲素含量只有0.016%，秦皮乙素含量更低，因此，白蜡树叶不可作为秦皮代用品。随着天然药物提取技术进步，提取成本降低，白蜡树叶可作为工业原料用于秦皮甲素的提取。

木犀科植物中与白蜡树近缘植物的根、树皮中秦皮甲素和秦皮乙素定性、定量测定已有诸多报道，其中左月明等报道了苦枥白蜡树（Fraxinus rhynchophylla Hance）、宿柱白蜡树（Fraxinus stylosa Lingelsh）叶中秦皮甲素的含量[4]，而关于白蜡树（Fraxinus chinensis Roxb.）叶中秦皮甲素定性、定量测定的研究鲜有报道。试验参照最新版中国药典方法测定，方法科学、简便，稳定性好，实用性强。

秦皮甲素和秦皮乙素为香豆素类化合物，在自然界中分布广，生物活性明确，试验只是初报，其在白蜡树不同部位、不同采集时间与含量的变化规律还要进一步探讨。鲁北地区多盐碱地，可供种植的植物种类少，而白蜡树在鲁北地区长势良好，在不破坏植被的情况下，充分利用落叶资源，又可以保持环境卫生，有利于区域经济发展。

参考文献

[1]

李小华，孙毅毅.秦皮甲素对高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝的防治作用[J].中国新药与临床杂志，2010，29（9）：679-683.

[2] 王晶. 秦皮甲素对人肺癌细胞H125体外增殖的影响[J].时珍国医国药，2011，22（2）：507-509.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社， 2010：254.

[4] 左月明，王振月，崔红花，等. 不同地理种源秦皮的树皮及叶中秦皮甲素、秦皮乙素的含量测定[J].中成药，2003，25（7）：36-38.