东方伊萨酵母菌对偶氮染料酸性大红GR的脱色优化及特性研究

卢婧 余志晟 张洪勋

摘要 [目的]优化东方伊萨酵母菌（Issatchenkia orientalis YP1）对偶氮染料酸性大红GR的脱色条件，初步阐明脱色机理。[方法]研究该菌在不同温度、pH、接种量、染料起始浓度、碳源和氮源条件对酸性大红GR的脱色影响，并且对脱色降解功能酶进行定位。[结果]该菌在16 h内对浓度为50～100 mg/L酸性大红GR的脱色率达96%，其机理主要为降解脱色。东方伊萨酵母菌YP1的最佳接种量不应低于10%，最佳pH 在4～8之间，最佳温度为28 ℃，（NH4）2SO4浓度在0.1% 以上，葡萄糖浓度不应低于1%。脱色后染料的主体结构被破坏，发生降解反应。该菌主要脱色降解功能酶为胞内酶。 [结论]东方伊萨酵母菌对酸性大红GR的脱色效果显著，在染料废水处理中将具有良好的应用前景。

关键词 酵母菌；东方伊萨酵母菌 YP1；偶氮染料；降解脱色

中图分类号 S187；X172 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02233-04

The Decolorization Optimization and Characteristics of an Azo Dye Acid Scarlet GR by Yeast Issatchenkia orientalis YP1

LU Jing， YU Zhisheng et al

（College of Resources and Environment， University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049）

Abstract [Objective] The study aimed to discuss the optimal conditions and preliminary decolorization mechanism for the decolorization and degradation of azo dye Acid Scarlet GR by yeast strain Issatchenkia orientalis YP1. [Method] The effect of different temperatures， pH， inoculation volumes， initial dye concentrations， carbon and nitrogen concentrations on decolorization with I.orientalis YP1 was discussed in detail， as well as its preliminary decolorization mechanism. [Result] This strain achieved a maximal decolorization （96%） for Acid Scarlet GR （50-100 mg/L） after incubation for 16 h. To get such decolorization， the optimal inoculation volume of this strain was set not less than 10%， optimal pH of culture medium ranging from 4 to 9， and concentrations of （NH4）2SO4 and glucose not lower than 0.1% and 1%， respectively. In addition， the results showed that the main structure of acid scarlet GR was destroyed after decolorization and the main functional decolorization enzyme was intracellular enzyme. [Conclusion] The yeast strain Issatchenkia orientalis YP1 has relatively strong decolorization capability on azo dye acid scarlet GR， which has a good prospect in the biodegradation of dye wastewater.

Key words Yeast； Issatchenkia orientalis YP1； Azo dye； Decolorization and degradation

染料廢水属于一类持久性难降解有机废水，已成为环境重点污染源之一。利用微生物强化处理技术进行染料污染治理被认为是去除这些污染物的最为经济、有效的方法，在处理工业废水、染料废水等方面已得到广泛的应用。高效脱色降解菌的筛选、脱色条件优化以及脱色机理的研究已成为国内外含染料废水生物处理技术的一个重要内容。染料微生物脱色降解机理复杂且多样，有些机制仍不明确，但是普遍认为染料的微生物降解是在多种酶的协同作用下完成的。为了解脱色酶的性质及其应用于实际废水处理的可能性，笔者选用合成染料中最广泛、用途最大的一类偶氮染料为研究对象，在实验室前期研究工作的基础上初步探讨东方伊萨酵母菌YP1对酸性大红GR最佳脱色条件和机理。

1 材料与方法

1.1 染料与菌株

酸性大红GR购自天津彩丽染料有限公司。东方伊萨酵母菌YP1由本实验分离、保存。

1.2 培养基

菌种活化培养基（液体，1 L）：蛋白胨20 g，酵母粉10 g，氯化钠20 g，琼脂20 g，pH 6.0；脱色培养基 （液体，1 L）：葡萄糖2 g，酵母粉1 g，氯化钠2 g，加水至1 L，pH 6.0；染料培养基：在脱色培养基基础上加入一定浓度的染料，一般情况下为100 mg/L。

1.3 菌体生长曲线的测定

将东方伊萨酵母菌悬液1 ml 接种到100 ml 脱色培养基中，在28 ℃、200 r/min 条件下振荡培养，分别在4、8、12、16、20、24、36 h取样，用UV4802H 型紫外可见光分光光度计测定菌株的OD560值[1]。以培养时间为横坐标，以OD560值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。

1.4 脱色条件优化

在28 ℃下，将已纯化好的东方伊萨酵母菌YP1在活化培养基上培养24 h。用接种环挑取一环已活化的酵母于150 ml 染料培养基中，200 r/min，28 ℃，摇瓶培养16 h。在不同温度、pH、接种量、染料起始浓度、碳源和氮源条件下，研究菌株对酸性大红GR的最佳脱色条件。

1.5 脱色率分析计算方法

取3 ml 脱色培养液于离心管中，8 000 r/min 离心20 min，取上清液用分光光度计测定其在酸性大红GR 最大吸收波长505 nm处的OD值，以不接酵母菌的脱色培养液为对照（CK），计算脱色率[2]。

脱色率（%）=（A-B）/A×100

式中，A为脱色前脱色培养液的OD 值；B为脱色后脱色培养液的OD值。

1.6 降解产物紫外-可见光连续扫描分析

将不同时段取样的50 mg/L 脱色液于8 000 r/min 离心20 min，取上清液进行紫外-可见动态扫描，分析菌株对染料的动态降解及产物生成情况。

1.7 脱色酶系的定位

1.7.1 上清液脱色试验。将已完全脱色的含染料培养液离心（8 000 r/min，20 min），取上清液5 ml移入150 ml染料培养基中，置于摇床中（200 r/min，28 ℃），定期测定溶液的染料吸光度。

1.7.2 粗酶液脱色试验。将已完全脱色的液体染料培养基离心收集菌体（8 000 r/min，20 min），用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤2次，再用相同的缓冲液重悬沉淀菌体，冰浴超声波破碎细胞40 min（400 W，3s/3s），4 ℃下12 000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液，取上清液2 ml，移入150 ml 染料液体培养基中，置于摇床（200 r/min，28 ℃），定期测定溶液的染料吸光度。

1.7.3 对照组脱色试验。设置一组既未破碎且未离心的染料脱色培养液与上清液组和菌体破碎组作对照（CK）。

2 结果与分析

2.1 生长曲线的测定

由图1可知，酵母菌生长曲线基本符合S型生长曲线模型，与传统的S 型比较起来对数生长期短，达到生长稳定期的时间延长。在0～4 h为生长延迟期，在4～16 h 为对数生长期，在16～36 h为稳定期，36 h后为衰亡期。在12 h时，东方伊萨酵母菌YP1生长最旺盛，且处于对数期，此时最适于接种。

图1 东方伊萨酵母菌YP1的生长曲线

2.2 不同条件对酸性大红GR脱色的影响

2.2.1 温度和pH。

温度是影响微生物生长的重要因素之一。温度主要通过影响酶的活性来影响微生物的生长速率和对营养物质的代谢速率。不同菌种的适宜温度不同[3]。该研究按10%接种量，将菌悬液接入脱色培养基中（染料质量浓度为100 mg/L），分别于20、28、37 ℃ 静置培养24 h，测定吸光度值。由图2可知，该菌株在3个温度24 h内都能达到较高的脱色率，达96% 以上。但是，在28 ℃条件下脱色速率最快，4 h内达83%，说明该菌体产生的酶在此温度具有较高的酶活性。因此，温度选取在28 ℃最佳。

图2 温度对脱色率的影响

由图3可知，不同pH条件下东方伊萨酵母菌YP1在培养24 h 后对酸性大红GR脱色有效果，东方伊萨酵母菌YP1对pH的适应范围较广。在测试的pH范围内，它都具有一定的脱色效果，最适pH 在4～8之间。当pH偏酸为2时脱色率较低，只有57%。研究表明，偶氮染料的微生物脱色最佳pH范围通常在6～10[4-6]，但有的微生物对pH的适应范围较窄，pH过高或过低都可能对脱色菌的生长造成不利影响。pH对脱色率的影响主要是通过影响酶的构象及电子传递过程，导致菌种对染料的脱色发生变化[7]。

图3 pH对脱色率的影响

2.2.2 接种量。

由图4可知，随接种量的增加，脱色效率越快。这是因为每单位体积染料与微生物接触的概率增大，越有利于菌体对染料的脱色。当接种量为10%（V/V）时，8 h即可达到95%以上的脱色率。而不同的接种量均可在16 h达到95%以上的脱色率，即在16 h后接种量对东方伊萨酵母菌YP1脱色的影响可以忽略。为了增加菌体对酸性大红GR的适应性，且不因接种量过大而降低染料的初始浓度，后续试验均以10% 的接种量来对染料脱色进行研究。

图4 接种量对脱色率的影响

2.2.3 酸性大红GR起始浓度。

由图5可知，在接种量为10%、28 ℃、pH 7 下摇床培养36 h，东方伊萨酵母菌YP1对不同起始浓度酸性大红GR脱色率有明显的差异。酵母菌脱色的速率随染料浓度的增加而降低，达到最大脱色率的时间依次推后。研究表明，50、100 mg/L的染料较适合东方伊萨酵母菌YP1的生长且具有高效的脱色作用，达到最大脱色率96%的时间不超过24 h，并且染料颜色接近无色，离心后的菌体为乳白色（不带酸性大红GR的红色）。推测该状态的脱色机制，可能为生物降解作用。在浓度为200 mg/L以上时，东方伊萨酵母菌YP1的生长开始受到抑制，启动较慢，离心后菌体呈现红色。此时，酵母菌对染料的脱色除了降解以外，还有吸附作用。在培养48 h 后，高于600 mg/L 的染料培养基脱色率仍小于18%，但仍有增加的趋势。随着染料浓度的增大，染料吸附量增大，染料对酵母菌的毒性增大，抑制了该菌的生长速率和脱色活性。总体而言，东方伊萨酵母菌YP1对酸性大红GR有良好的降解效应，对环境有较强的适应能力和耐冲击能力。与一些細菌、丝状真菌和其他酵母菌[8-12]相比，东方伊萨酵母菌YP1对染料进行脱色的能力和速率均具有明显的优势。

為了便于研究其他条件对脱色的影响，确定以100 mg/L 的染料进行后续试验，因为该浓度在实际染料废水中该浓度已较高。

图5 染料起始浓度对脱色率的影响

2.2.4 碳源和氮源。

该研究分别采用0、0.02%、0.10%、0.50%和1.00%的葡萄糖浓度和（NH4）2SO4浓度（培养液其他成分含量同脱色培养液），考察碳源和氮源含量对东方伊萨酵母菌YP1脱色的影响。

由图6可知，在不添加葡萄糖条件下，24 h后东方伊萨酵母菌YP1对酸性大红GR 脱色率很低，还不到17%。随着葡萄糖浓度的增加，东方伊萨酵母菌YP1的脱色率增加。当葡萄糖浓度增至1%时，脱色率达到最大，为99%。这说明要获得理想的脱色效果需要提供碳源，东方伊萨酵母菌YP1对酸性大红GR的脱色可能是共代谢作用的结果，而不能直接利用染料分子为碳源。同该菌株类似，陈曦等[8]报道，当葡萄糖浓度从0.05%增至1.00%时，酵母菌Y48对活性黑KNB（100 mg/L）的脱色率从培养24 h的11% 增至100%。此外，东方伊萨酵母菌YP1未发生在葡萄糖过量时对染料的脱色效果的降低如沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）[9-10]的现象。

由图6可知，当（NH4）2SO4的浓度在0.02%～1.00%之间时，24 h后脱色率无显著差异。在不加氮源（NH4）2SO4的情况下，

东方伊萨酵母菌

YP112 h 后脱色率就能达到95%。这可能是由于该酵母菌能够利用染料分子为氮源。但是，当氮源浓度增加时，染料的脱色速率得到明显提高。这表明添加一定的氮源对东方伊萨酵母菌YP1脱色酶活性的启动有帮助。该试验中（NH4）2SO4浓度应在0.1% 以上。有报道表明，对于有些微生物，增加氮源有利于提高染料废水的脱色效果。Xu等[11]研究表明，撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerate） P2在以尿素为氮源降解甲基橙时，脱色率随着尿素浓度的增加呈线性增加；也有研究表明，限氮能促进白腐真菌产酶，有利于稳定关键酶的活性，并且发挥其对活性染料的脱色、降解功能[12-14]。

图6 不同葡萄糖浓度和（NH4）2SO4浓度对脱色率的影响

2.2.5 脱色液动态扫描。

由图7可知，50 mg/L酸性大红GR脱色不同时段取样，505 nm 处为酸性大红GR的最大吸收峰。随着菌株对染料的降解脱色，最大吸收峰a（0 h）、b（4 h）、c（8 h）、d（12 h）和f（36 h）依次降低，说明染料结构发生改变。在4 h，东方伊萨酵母菌YP1对酸性大红GR的脱色率为69.1%，12 h时染料则基本被降解。在36 h脱色过程中，未检测到新的吸收峰出现，可能是东方伊萨酵母菌YP1将酸性大红GR 分子彻底降解成水和二氧化碳，或转化成其他微量小分子，而它们在该测量方法中未能被检测到。

2.2.6 脱色酶的定位试验。

由图8可知，东方伊萨酵母菌YP1脱色后的上清液、粗酶液的上清液和对照组胞内酶和胞外酶都对酸性大红GR有脱色能力，但是效果差异明显。脱色后上清液对染料脱色效果很差，对高浓度600 mg/L酸性大红GR 24 h后脱色率仅4.51%。而东方伊萨酵母菌YP1粗酶液的上清液对高浓度600 mg/L酸性大红GR脱色效率非常显著，24 h即达到96%以上，且脱色速率很快。这说明东方伊萨酵母菌YP1对酸性大红GR脱色起主要作用的脱色功能酶主要存在于细胞中，为胞内酶。经过破碎，完整细胞破坏，酶从细胞内释放出来，很快与染料作用，使得脱色速度更快，效果更好。

通常来说，微生物对染料的脱色一般有吸附脱色和降解脱色2种机理。染料分子先吸附在菌体上，然后通过细胞酶的作用逐渐降解，其中吸附脱色机理主要是：构成菌体表面的脂肪、蛋白质、糖类等物质的一些集团通过化学键、离子键或氢键与染料作用，形成染料与大分子构成的复合物，这些物质通过分子间作用力进一步与其他染料分子进行作用，导致菌体对染料有较好的吸附[15]；而降解脱色机理主要是染料在菌体各种酶的作用下降解，主要是偶氮还原酶的还原脱色[16-17]。在不同浓度的染料胁迫下，细胞内的酶会发生不同程度的变化。

3 结论

（1）东方伊萨酵母菌YP1对酸性大红GR脱色的优化控制条件为：28 ℃为宜，最适pH 在4～8 之间，接种量应不低于10%，（NH4）2SO4 浓度应在0.1% 以上，葡萄糖浓度应不低于1%。

（2）东方伊萨酵母菌YP1对不同浓度（50～800 mg/L）的酸性大红GR具有不同程度的脱色效果。当染料浓度小于200 mg/L时主要是生物降解脱色，浓度高于400 mg/L时脱色是由生物吸附和生物降解2种机制完成的。

（3）东方伊萨酵母菌YP1的胞内酶对酸性大红GR的降解脱色起主要的作用。

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