水曲柳节律相关獹IGANTEA基因的克隆及同源性比对分析

苏秋钰　方传雷　曹羊等

摘要

[目的]对水曲柳节律相关GIGANTEA基因的克隆及同源性进行比对分析。[方法]根据GenBank中GI基因保守结构域设计简并引物，进行PCR分析，并与其他物种的氨基酸序列进行同源性比对分析。[结果]获得了编码区780 bp的部分序列，可以编码260个氨基酸，获得的GI基因命名为FmGI，与多个物种GI基因有着较高的同源性，其中与葡萄、大豆、苜蓿、毛果杨、蓖麻、黄瓜、菊花、大麦、玉米、小麦、拟南芥、黑麦草、洋葱和云杉等多个物种具有较高一致性。系统发育树分析结果表明，GI基因按照单子叶植物、双子叶植物和裸子植物的进化关系聚为3类，明确了水曲柳GI基因的系统进化关系。[结论]该方法对水曲柳生物节律钟GI基因编码区进行了克隆，并对获得的部分GI蛋白序列进行了同源性比对分析，建立了系统进化树，为进一步获得水曲柳GI基因全长及研究其功能起到一定参考作用。

关键词 水曲柳（Fraxinus mandshurica）；GIGANTEA；生物节律；光周期；同源性分析；系统进化树

中图分类号 S792.12 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02297-04

Cloning and Homology Analysis of Biological Rhythms Related GIGANTEA Gene in Fraxinus mandshurica

SU Qiuyu， ZENG Fansuo et al

（College of Life Sciences， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To comparatively analyze cloning and homology of biological rhythms related GIGANTEA gene in Fraxinus mandshurica. [Method] Using degenerate primers corresponding to conserved domains of GI gene in GenBank， PCR analysis was conducted， as well as homology analysis with amino acid sequence of other species. [Result] The length of the fragment obtained was 780bp， ORF predicted the protein was component of 260 amino acids. The homology analysis， of the obtained fragment showed that， it had a high consistency with Vitis vinifera， Glycine max， Medicago truncatula， Populus trichocarpa， Ricinus communis， Cucumis

sativu， Chrysanthemum seticuspe， Hordeum vulgare， Zea mays， Triticum aestivum， Arabidopsis thaliana， Lolium perenn， Allium cepaand， and Picea abies. Phylogenetic analysis showed that according to monocots， dicots and gymnosperms， the evolutionary relationship of GI gene clustered into three categories. The obtained GI gene clustered with dicots， it showed a clear phylogenetic relationship of GI gene in Fraxinus mandshurica. [Conclusion] The study provide a reference for further obtaining Fraxinus mandshurica GI gene full length and researching its functions.

Key words Fraxinus mandshurica； GIGANTEA； Biological rhythms； Photoperiod； Homology analysis； Phylogenetic tree

生物能夠通过不断调节自身的生长和发育状态以适应季节与环境变化。许多物种通过光周期来识别不同季节[1]。高等植物可以感受不同季节昼长的振荡变化，并调节启动开花进程的时间。这是环境信号和节律基因参与时间调控机制的复杂的相互作用结果[2]。生物节律基因GIGANTEA（GI）是生物钟的重要组件，在多种植物开花时间调控中起作用[3-8]。模式生物拟南芥的研究表明，GI基因的功能是在春季和夏季等长日照通路中启动开花[9-10]。gigantea（gi）和constans（co）等基因介导了拟南芥光周期调控通路，即其在长日照条件（LD）下响应并促进开花过程[11-12]。长日照中，生物钟（内部计时器，调控24 h的植物节律）和节律调控开花时间基因与感受器的互作过程中，促进了CO蛋白的积累，随后转录激活开花整合基因FLOWERING LOCUS T（FT）来启动开花进程。并且，GI基因还受到生物节律钟的调控。

生物钟是生物内部24 h的振荡器，调节每天的节律[13-17]。研究表明，GI的表达也受到节律基因调控，其转录水平在日出8～10 h后达到峰值。出峰时间、峰高和持续时间受到日照长度的影响。并且GI可以与LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY），CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和EARLY FLOWERING 3 （ELF3）基因相互作用，在光周期启动的开花过程中，对开花时间相关基因起到重要调控作用[8-9]。此外，GI通过miR172调控一个与CO基因独立的通路，并调控开花过程[18]。对于GI突变体的研究表明，GI基因在不同的生物进程中起着多效作用[19-20]。拟南芥GI基因翻译后的蛋白预测为1 173个氨基酸，分子量为127 kDa[8-9]。与GI基因转录表达相似，白天GI蛋白水平也呈周期性变化，在日出12 h达到峰值；在夜间，GI与E3泛素连接酶CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1 （COP1）和时钟相关ELF3形成了一个复合物，这个过程导致了黑暗中GI蛋白含量的下降[21]。

水曲柳（Fraxinus mandshurica）为木犀科白蜡属（Fraxinus）植物，树高可达30 m，胸径可达60 cm以上，是东北林区的主要造林树种。水曲柳是东北3大珍贵硬阔叶用材树种之一，是阔叶树种中适应性较强、生态价值和经济价值较高的优良珍贵树种[22]。笔者以水曲柳为材料，根据GenBank中GI基因保守结构域设计简并引物进行PCR，克隆GI基因部分编码区序列，分析水曲柳GI基因的系统进化关系，以期为深入研究水曲柳GI基因的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

研究对象。水曲柳（Fraxinus mandschurica），取材于东北林业大学实验林场，取水曲柳新鲜叶片，液氮速冻后-80 ℃保存备用。

1.1.2

主要试剂。Primer star Taq酶、凝膠回收试剂盒、T4 DNA连接酶、JM109感受态细胞和pMD18-T载体，均购自于宝生物工程（大连）有限公司；扩增引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1

水曲柳GI基因编码区片段的克隆。以水曲柳幼嫩叶片作为材料，应用CTAB法提取总RNA。应用反转录试剂盒将RNA反转录成为cDNA。根据已发表的拟南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、车前草（Plantago）、黑麦草（Lolium perenne）、菊花（Chrysanthemum）、欧洲山杨（Populus tremula）的GI核苷酸序列，设计简并引物（表1），以水曲柳cDNA为模板，对GI基因进行扩增。PCR扩增反应条件如下：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；共30个循环；72 ℃延伸10 min。应用凝胶回收试剂盒对特异性扩增产物回收纯化，纯化产物与pMD18-T载体连接，转化克隆进入JM109感受态细胞，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.2

水曲柳GI基因的同源性比对分析。利用NCBI数据库Blast以及PRALINE等在线分析软件，对GI基因序列以及推测的编码蛋白进行同源序列比对，搜索不同物种中的同源基因及蛋白。根据李军等推荐的软件组合[23]，先采用ClustalX将氨基酸序列进行多序列比对的分析，然后利用MEGA 5.0 软件，算法为NeighborJoining，自检举1 000次，构建进化树[24]。

2 结果与分析

2.1 水曲柳总RNA的提取

图1表明，在提取过程中并未出现降解。利用紫外分光光度计进行浓度检测，RNA样品的OD260/OD280均在1.9～2.0，纯度较高，能够用于后续的反转录试验。

图1 水曲柳总RNA的提取

2.2 水曲柳GI基因编码区片段的获得

图2表明，连接pMD18-T载体，转化JM l09感受态细胞后，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行PCR检测。将菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序验证。获得的水曲柳GI基因的cDNA片段应用DNAMAN软件进行分析和预测，推测的氨基酸序列如图3所示。

图2 简并引物PCR扩增产物凝胶电泳图谱

图3 水曲柳GI 基因cDNA序列及其推测的氨基酸序列

2.3 水曲柳GI基因编码区片段的同源性分析

克隆后测序的结果应用NCBI网站（http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/）BlastN和BlastX程序进行了序列和功能同源性比对分析。BlastX分析结果表明，获得的GI基因编码区部分片段与多个物种GI基因氨基酸序列同源，其中与葡萄（Vitis vinifera，XP_002264755.1）、大豆（Glycine max，BAJ22595.1）、苜蓿（Medicago truncatula，XP_003592047.1）、毛果杨（Populus trichocarpa，XP_002307516.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002524341.1）、黄瓜（Cucumis sativus，XP_004163795.1）、菊花（Chrysanthemum seticuspe，BAM67030.1）、大麦（Hordeum vulgare，AAL08497.2）、玉米（Zea mays，AFW80282.1）、小麦（Triticum aestivum，AAT79487.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，ABP96483.1）、黑麦草（Lolium perenne，CAY26028.1）、洋葱（Allium cepa，ACT22764.1）和云杉（Picea abies，AGH20049.1）的一致性分别为69%、69%、67%、70%、68%、68%、68%、61%、59%、61%，64%、59%、59%和48%。

应用PRALINE（http：//www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/）在线多序列比对软件分析对不同物种GI蛋白序列进行多序列比对分析（图4）。结果显示，试验获得的GI蛋白序列，与葡萄、大豆、苜蓿、毛果杨、蓖麻、黄瓜、菊花、大麦、玉米、小麦、拟南芥、黑麦草、洋葱和云杉等物种GI蛋白序列相比具有很高的保守性。

2.4 水曲柳GI基因的系统进化树的构建

系统进化树是物种的进化史，通过构建系统进化树可以根据这些物种的祖先描述它们的进化关系。先采用ClustalX对14个物种的GI基因的氨基酸序列进行多序列比对的分析，其中包括葡萄（Vitis vinifera，XP_002264755.1）、大豆（Glycine max，BAJ22595.1）、苜蓿（Medicago truncatula，XP_003592047.1）、毛果杨（Populus trichocarpa，XP_002307516.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002524341.1）、黄瓜（Cucumis sativus，XP_004163795.1）、菊花（Chrysanthemum seticuspe，BAM67030.1）、大麦（Hordeum vulgare，AAL08497.2）、玉米（Zea mays，AFW80282.1）、小麦（Triticum aestivum，AAT79487.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，ABP96483.1）、黑麦草（Lolium perenne，CAY26028.1）、洋葱（Allium cepa，ACT22764.1）和云杉（Picea abies，AGH20049.1），然后利用MEGA 5.0 软件，算法为Neighbor-Joining构建进化树。图5表明，从遗传距离上看，这些物种的GI基因的亲缘关系都比较接近，主要聚为3大类，其中被子植物中，双子叶植物毛果杨、蓖麻、葡萄、黄瓜、大豆、苜蓿、菊花、拟南芥和水曲柳聚为1类，单子叶植物洋葱、玉米、黑麦草、大麦和小麦聚为1类；裸子植物云杉单独聚为1类。

3 结论与讨论

植物生物节律钟基因的研究越来越受到研究者的重视。例如，节律基因LHY/CCA1和TCO1基因参与了生物节律钟中心振荡器的负反馈调节循环。此外，开花时间通路的分析表明，生物节律钟的转录调控作用与光的转录后调节作用一起可以激活响应昼长并调控开花时间的蛋白[2]。拟南芥GI基因是光周期开花通路中的核心组件。编码蛋白定位于细胞核，是植物特异性蛋白，在CO基因上游起作用。GI的mRNA上下的振动受到昼夜节律的调控，在日出8～10 h后含量达到峰值，但是GI基因同时会反馈调节生物钟，维持昼夜的正常节律。拟南芥gi突变体中CO基因的表达下降了，而GI基因的过表达可以增加CO的mRNA表达水平，并可以促进植物在短日照（SD）条件下开花。gi突变体的在连续光照或黑暗下，其常规昼夜节律会被扰乱，并且延迟起作用[25-26]。

試验利用GenBank上已发表的GIGANTEA（GI）基因的氨基酸序列，设计简并引物，对水曲柳GI基因进行扩增，获得了编码区780 bp的部分序列。经过分析发现其可以编码260个氨基酸。获得的GI基因序列与多个物种GI基因有着较高的同源性，其中与葡萄、大豆、苜蓿、毛果杨、蓖麻、黄瓜、菊花、大麦、玉米、小麦、拟南芥、黑麦草、洋葱和云杉等一致性分别为69%、69%、67%、70%、68%、68%、68%、61%、59%、61%，64%、59%、59%和48%。对其氨基酸序列的比对分析发现，获得的GI蛋白序列与其他物种的同源性也较高。进化树的结果表明，GI蛋白家族保守性较高，大体按照单子叶植物、双子叶植物和裸子植物的进化关系分为3类。试验获得的水曲柳GI部分氨基酸序列，也与双子叶植物毛果杨、蓖麻、葡萄、黄瓜、大豆、苜蓿、菊花和拟南芥聚为一类，符合进化关系。

试验对水曲柳生物节律钟GI基因编码区进行了克隆，并对获得的部分GI蛋白序列进行了同源性比对分析，建立了系统进化树，对进一步获得水曲柳GI基因全长及研究其功能起到一定参考作用。

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