洋桔梗小孢子培养初步研究

王小巧　 朱芮　 李琼洁等

摘要 [目的]探索预处理和培养基类型对小孢子离体培养的影响。[方法]以洋桔梗为材料进行小孢子培养，研究预处理和培养基类型对小孢子离体培养的影响，并筛选胚性愈伤组织适宜诱导培养基、不定芽植株培养基以及最佳生根培养基。[结果]利用4 ℃低温预处理 24 h 有利于小孢子愈伤组织的形成。愈伤组织适宜诱导培养基为：MS+3 mg/L KT+ 2.5 mg/L 2，4-D；不定芽植株培养基为MS+1 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA；最佳生根培养基为：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA +1.5 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭。经过染色体倍性鉴定，显示小孢子培养后染色体数目减半。[结论]该方法研究了预处理和培养基类型对小孢子离体培养的影响，为洋桔梗游离小孢子培养体系的建立以及单倍体育种奠定基础。

关键词 洋桔梗（Eustoma grandiflorum）；小孢子；离体培养；愈伤组织

中图分类号 S682.3 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）08-02291-04

Preliminary Study on Microspore Culture of Eustoma grandiflorum

WANG Xiaoqiao， HE Fengmei et al （College of Horticulture and Landscape， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201）

Abstract [Objective] To explore effects of pretreatment and culture medium types on microspore in vitro culture. [Method] With Eustoma grandiflorum as material， effects of pretreatment and culture medium types on microspore culture were studied. The appropriate induction culture medium， adventitious bud plant culture medium and optimum rooting culture medium for callus were obtained. [Result] The result showed that treating microspore 4℃ for 24 hours benefited the growing of callus. Solidliquid medium containing MS+3mg/L KT+2.5 mg/L 2.4D was conducive to callus induction， medium containing MS+1 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L Sucrose+6.1 g/L Agar was beneficial to adventitious buds induction， suitable medium for root growth contained MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.5mg/L IBA+30 g/L Sucrose +6.1 g/L Agar+0.3 g/L Active carbon. Result of the chromosome ploidy identification showed that the chromosome numbers were halved through microspore culture. [Conclusion] The effects of pretreatment and culture

medium types on microspore in vitro culture were studied， which will lay a foundation for establishment of Eustoma grandiflorum microspore culture system and haploid breeding.

Key words Eustoma grandiflorum； Microspore； Culture in vitro； Callus

洋桔梗（Eustoma grandiflorum）又名草原龍胆，为龙胆科草原龙胆属（Eustoma）植物，瓶插期长、耐长途运输，花姿雅丽，花形别致，花色丰富，具有较高的观赏价值，是世界上十分流行的高档切花之一[1]。我国各地也竞相引种栽培，极具市场开发前景。但其种源主要是从国外进口F1代杂种，价格昂贵[2]。洋桔梗是异花授粉植物，容易授粉，种子量多，自交存在衰退现象，自交系之间杂交（F1）表现出超强杂种优势。由于国外引进洋桔梗品种复杂的遗传背景，使其F1代杂交种子后代分离严重，不能留种种植，因此，传统的洋桔梗花卉育种常采用杂交一代（F1）育种程序进行。在杂种优势利用中，亲本必须是纯合的，经组配后才能得到性状一致具有强杂种优势的杂交种。洋桔梗常规的育种方法选育自交系，获得一个纯系需要6～8年，时间期限长，选择效率低，耗费大量的人力和物力，再加之洋桔梗为异花授粉，存在自交衰退现象，从而导致洋桔梗自交系的获得较困难[3]。

通常由小孢子培养来获得纯合材料仅需要1～2年时间，大大缩短自交系选育年限，加速育种进程，提高育种效率，是现代植物育种中快速、高效的育种途径之一[4-5]。国内外已有利用小孢子培养获得植物自交系的报导[6-8]，但关于洋桔梗小孢子培养获得单倍体自交系的研究鲜有报道。笔者开展洋桔梗小孢子培养技术研究，以期为解决我国洋桔梗杂交种子生产问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。供试洋桔梗材料，来自玉溪市通海县瑞园园艺有限公司，经鉴定为龙胆科草原龙胆属（Eustoma）植物洋桔梗（Eustoma grandiflorum）。

1.1.2 主要试剂。所用试剂均为遇分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1 小孢子的分离纯化。采集田间健壮植株上的花蕾，在4 ℃的冰箱中放置1～2 d，进行抗寒锻炼。取出后用洗涤液清洗外表面并用流动水冲洗 5 min，在超净工作台上用浓度75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡 10～15 min，无菌水洗涤3次，每次5 min。沥干水分后，在B5培养基中用玻璃棒碾压花蕾，挤出小孢子。小孢子悬浮液经孔径300目的尼龙网1 000 r/min下离心3次，时间分别为15、10和5 min，弃上清液，加入MS培养液混合，用移液器取3.0 ml混合液于MS固体培养基中，25 ℃下暗培养1周，转至光照培养。

1.2.2 愈伤组织诱导芽分化的培养。将在光照下培养长出的愈伤组织转接至含有不同浓度6BA和NAA的MS培养基上进行固体培养，诱导芽分化。温度25 ℃，光照2 000 lx，pH值5.8～6.0。

1.2.3 生根培养。将上述长出的小苗，转入含有6BA、NAA和IBA的MS生根培养基上进行培养。采用5组处理，处理1：MS+0.2 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L活性炭；处理2：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭；处理3：MS+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭；处理4：MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭；处理5：MS+0.5 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭，2周后进行生根统计。

1.2.4 小孢子再生植株倍性鉴定。取田间生长的“ceremony orange”植株和小孢子再生植株根尖1.0～1.5 cm放入0.002 mol/L的8羟基喹啉中固定24 h，用无菌水冲洗3次，放入卡诺氏溶液中（无水乙醇∶冰醋酸=3∶1，V/V）2 h，无菌水冲洗干净后，在1 mol/L的HCl中浸泡5～10 min，无菌水冲洗3次，制片，卡宝品红染色，显微镜下检测染色体数目变化。

2 结果与分析

2.1 不同因素对小孢子胚性愈伤组织诱导率的影响

2.1.1 花蕾大小对小孢子胚性愈伤组织诱导率的影响。小孢子的发育时期是影响小孢子培养的关键因素之一，选择合适的花粉发育时期可极大地提高植株小孢子胚性愈伤组织发生的诱导频率。图1表明，随着花蕾的长度的增加，胚性愈伤组织诱导率增加，当花蕾大小在2.0～2.5 cm时，胚性愈伤组织诱导率达到最大；当花蕾长度超过3 cm时，胚性愈伤组织诱导率降低。因此，当花蕾大小2.1～2.5 cm时，胚性愈伤组织诱导率高，达到76%。对花蕾的小孢子进行检测，证实此时期正是小孢子单核靠边期。

图1 花蕾大小对小孢子胚性愈伤组织诱导率的影响

2.1.2 低温预处理对小孢子愈伤组织诱导率的影响。低温预处理是小孢子培养的一个关键，适宜的低温和处理时间可改善小孢子代谢活动，有利于小孢子适应离体后的培养环境，促使小孢子正常生长。图3表明，不同的低温处理对小孢子愈伤组织诱导有一定作用，当温度处于4 ℃，愈伤组织诱导率最高。随着处理时间的增加，愈伤组织诱导率增加，当处理时间达到24 h时，愈伤组织诱导率达到最大，随着时间的再增加，诱导率降低。因此，最佳的预处理时间和温度分别为24 h和4 ℃。

图2 低温预处理对小孢子愈伤组织诱导率的影响

2.1.3 不同水平的生长调节剂激素对小孢子愈伤组织诱导率的影响。培养基成分对小孢子胚的诱导和形成影响极大，其中蔗糖浓度、不同植物生长调节物质及添加有机营养成分至关重要。每个配方重复5次。由表1和图3可知，培养20 d后，MS+3.0 mg/L KT+2.5 mg/L 2.4D诱导的胚性愈伤组织最多，其诱导率达75%。MS+2.0 mg/L KT+2.5 mg/L 2.4D诱导的胚性愈伤组织最少，其诱导率为28%。

2.2 芽诱导及生根培养

2.2.1 不同水平的植物生长调节剂对诱导芽的影响。采用不同水平的植物生长调节剂诱导愈伤组织出芽，每个处理设5次重复，每个重复接种4个胚性愈伤组织，共20个愈伤组织。由表2可知，MS+1.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA诱导芽的效率最好，达到85%。MS+2.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA和MS+2.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA均未出苗。

圖4 愈伤组织诱导芽分化

2.2.2 不同水平的植物生长调节剂对植株生根的影响。采用5个不同处理，观察不同水平的植物生长调节剂对生根的影响。结果表明：不添加IBA或者6BA生根率都很低；当6BA的浓度超过0.2 mg/L IBA或浓度低于1.5 mg/L植株的生根率都不佳。因此，6BA浓度过高、IBA浓度过低都影响洋桔梗生根率。选择合适的浓度是植株生根的关键。诱导植株生根的最佳配方为：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭生根率最佳，可达到80%以上。

2.3 染色体数目的比较 对小孢子培育植株及田间四倍体植株进行染色体数目检测[9]，共检测10棵植株，30条根，观察60个细胞。发现小孢子培育植株根尖染色体数均为36条，田间四倍体植株根尖染色体数为72条。由此说明，试验进行的小孢子组织培养苗是二倍体。

3 结论与讨论

通过花药和小孢子离体培养技术开展植物单倍体育种工作是现代生物技术育种最有效的手段之一，但在植物花药组织培养中，很多情况下获得的再生植株中并没有单倍体植株的存在，花药培养获得的再生植株绝大部分是来自于花药壁的二倍体细胞，也有可能少量来自单倍性的花粉粒。因此，单倍体出现的频率很低，甚至没有，因而，不能形成足够的选择群体，同时也导致再生植株混杂（混倍），要从这样的混杂植株中再挑选出单倍体植株费工费时。从培养过程来看，花药离体培养相对较容易，技术比较成熟，而小孢子离体培养尽管不受花药壁、药隔等二倍体细胞的干扰，但这种特殊单倍体细胞的培养技术难度较大，目前只在少数植物上获得成功[10]。

小孢子培养技术是一种高效、安全的育种新途径，能快速地从大量群体中获得新的种资源。并且有力地缩短了杂交育种的年限。另一方面该技术的应用可以为植物的新种质的创建和新品种的快速选育提供新的思路、途径和方法[11]。

花蕾中小孢子发育的一致性对胚状体或愈伤组织的再生有很大影响。不同品种单核靠边期的花蕾发育时期是不一样的，同一品种生长环境不一致，其单核靠边期的花蕾发育时期也不一致。试验通过莱卡显微镜镜检发现，采集的洋桔梗“ceremony orange”花蕾在2.0～2.5 cm时处在单核靠边期，处在该时期的花蕾胚性愈伤组织诱导率高达到76%；再生植株诱导率100%。与其他小孢子培养不同的是胚性愈伤组织诱导并非采用NLN13液体培养基，而是采用MS固液培养，一方面胚性愈伤组织诱导率相对液体培养提高很多，另一方面可以大大降低污染率。组织培养过程中愈伤组织易出现褐化以及活力不足，但在培养基中加入0.1 g/L的活性炭并且及时的更换新鲜培养基可以有效的减轻褐化现象。对于再生植株根尖染色体的鉴定，根尖在9点前取要比在其他时间取得根尖效果好，能够较清楚的看清染色体的条数。随着小孢子培养条件的不断改善 和培养技术的进一步改进。小孢子培养技术和单倍体育种手段将在草原龙胆属作物的育种领域中发挥出更大的作用。

参考文献

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