红碱淖遗鸥血液基因组DNA提取方法的比较研究

行文珍，雷 忻，戚珍珠，田鹏飞，张静静

(延安大学 生命科学学院，陕西 延安 716000)

遗鸥(Ichthyaetus relictus)，隶属于鸻形目(Charadriiformes)鸥科(Laridae)鸥属(Larus)［1］，目前繁殖地集中在蒙古国(数处)、哈萨克斯坦(2处)、俄罗斯(1处)和中国(1处)，其越冬地在中国和韩国亦有发现［2－3］。1931年，瑞典博物学家艾纳·隆伯格(Ejnar Lonnberg)首次撰文提及其在中国内蒙古额济纳旗境内发现的遗鸥标本，但其认为遗鸥是黑头鸥在东方的一个变种。1971年才被苏联鸟类学家Auezov确立为有效物种［4］，同时被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)和《迁徙物种公约》(MSC)附录Ⅰ，在IUCN发布的《红皮书》一直被列为受威胁鸟种，是世界珍稀濒危鸟类，也是我国一级保护鸟类［5－6］。目前，陕西省神木县红碱淖湿地是国内最大的遗鸥繁殖种群［7］，针对该种群开展分子生物学研究，对于拯救和保护这一濒危鸟种具有重要的科学价值和实际意义。

分子生物学技术在珍稀濒危鸟类的遗传、进化、种群关系、物种鉴定、性别鉴定等多方面的研究都有较广的应用，但是由于珍稀濒危鸟类取样困难，十分珍贵，因此选择高效的DNA提取方法尤为重要。本文采用改良的Miller的盐析法和酚－氯仿法分别对红碱淖遗鸥血液基因组DNA进行提取，并比较2种方法的提取效果，以期筛选简便、实用、经济的有效提取方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

遗鸥血液样品，采集于陕西省神木县红碱淖湿地，－20℃冷冻保存。

1.2 试验方法

参照柯柳玉［8］、王敏强［9］的禽血基因组 DNA提取方法并加以改良，分别采用酚－氯仿法和改良Miller盐析法从遗鸥冷冻血液样品中提取基因组DNA，酶解时间分别为10 h和16 h。

1.2.1 酚－氯仿法

取适量冷冻血液于室温下自然解冻，置于离心管中，加入10倍体积的动物血裂解液，颠倒混匀，再加入蛋白酶K使其终浓度达到100 μg/mg，颠倒混匀，55℃水浴10 h。加入等体积酚，轻轻颠倒混匀20 min，4℃ 12000 r/min离心5 min，取上清，重复上面步骤一次，取上清于另一洁净离心管中，加入等体积酚、氯仿和异戊醇混合液(体积比=25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀20 min，4℃ 12000 r/min离心5 min，取上清重复上一步骤，取上清加入等体积的氯仿和异戊醇混合液(体积比=24∶1)，轻轻颠倒混匀20 min，4 ℃ 12000 r/min离心5 min，取上清，加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠溶液(pH=5.2)，二倍体积预冷的无水乙醇，室温放置15 min，12000 r/min离心5 min，弃上清，再用75%乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥后溶于20 μL无菌水。

1.2.2 改良Miller盐析法

参照任春环［10］、苗永旺［11］的基因组快速提取方法。取适量冷冻血液置于室温下自然解冻后，将其转移至1.5 ml离心管中，加4倍体积的红细胞裂解液，混匀，4℃ 12000 r/min离心5 min，弃上清，重复上面步骤，至细胞团成粉白色。加8倍体积的生理盐水混匀，4℃ 12000 r/min离心5 min，弃上清。加入3 mL NLB(白细胞裂解液))+SDS(十六烷基硫酸钠)缓冲液，50 μL 蛋白酶 K 溶液，400 μL 10%SDS溶液，混匀，55℃ 10 h加入1/4体积6 mol/L NaCl，颠倒混匀，4℃ 12000 r/min离心10 min。取上清于加入2倍体积的预冷无水乙醇中沉淀，轻摇至DNA析出，静止30 min，12000 r/min离心2 min，小心倒掉上清液。用75%乙醇洗涤沉淀2次。室温干燥后溶于20μL无菌水。

1.2.3 DNA质量检验

取0.15 g琼脂糖放入锥形瓶中，加入10 mL 0.5×TBE(四溴乙烷Tetra Bromo Ethane)缓冲液，置于微波炉中加热至完全融化并摇匀，则为0.8%琼脂糖凝胶液。

取制胶梳、制胶板，用蒸馏水洗净晾干后置水平位置。放好梳子后，将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液沿胶板一侧缓慢地一次性倒入，注意不要形成气泡。室温凝胶大约30 min，胶凝固后拔出梳子，将胶放入电泳槽内，在其中加入0.5×TBE电泳缓冲液。

取5 μL DNA 原液与2 μL 10 ×Loading Buffer混匀，然后点入加样孔，接通电泳槽与电泳仪的电源，电压80 V，30 min，停止电泳。取出胶放入EB溶液中染色约10 min后，使用凝胶成像仪检测结果。

2 结果与分析

2.1 直接观察

酚－氯仿法提取遗鸥基因组DNA呈絮状，易干燥，易溶解;改良Miller盐析法提取遗鸥基因组DNA呈丝胶状，不易干燥，难溶解。

2.2 琼脂糖凝胶电泳

图1 酚－氯仿法和改良Miller盐析法提取遗鸥基因组DNA电泳图

图2 酚－氯仿法不同酶解处理时间DNA电泳图

由图1可见，酚氯仿法获得的DNA样品亮度高和清晰度很高，条带较粗，降解少，基本无拖尾现象;改良Miller盐析法样品亮度和清晰度均不高，条带较细，有拖尾现象，表明酚 －氯仿抽提法提取的DNA浓度高于改良Miller盐析法。

由图2可见，酚－氯仿法提取DNA时，蛋白酶K水解10 h和16 h时的提取结果有明显差异，酶解时间为10 h提取出来的样品清晰度不高，条带较细，而酶解时间为16 h提取出的样品亮度和清晰度明显较高，条带较粗。表明水浴时间越长，提取的DNA浓度越高。

3 讨论

任春环［10］等在提取山羊全血DNA时，比较了酚－氯仿抽提法、碘化钾法方法，认为改良Miller盐析法操作步骤复杂、时间长。曹岩峰［12］等采取酚－氯仿抽提法提取了牛凝血块基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和PCR检测，结果良好，只是浓度偏低。曹果清［13］等对组织中提取DNA的方法进行改进，先对凝血块进行预处理，用组织DNA抽提液裂解细胞，然后经过酚－氯仿抽提无水乙醇沉淀等步骤即可获得浓度高、纯度好、结构完整的DNA分子。Pietro［14］、Wang［15］等也认为酚 － 氯仿法较其他方法好。本研究结果显示，酚－氯仿法和改良Miller盐析法对遗鸥基因组DNA提取都较为有效，但两种方法相比较，酚－氯仿法提取的DNA总量与质量较好，且稳定，而改良Miller盐析法虽操作比较简单，但提取DNA纯度和质量均较差些。因此，酚－氯仿法在红碱淖遗鸥冷冻血液基因组DNA的提取中，效果明显优于改良Miller盐析法。

蛋白酶K能有效地分离核酸和蛋白质，其消化时间是影响DNA提取效果的关键因素。目前，大多数研究采用55℃水浴过夜的方式进行消化，这是传统酚－氯仿法中最耗时的环节。本研究分别采用酚－氯仿法酶解10 h和16 h的方法，对遗鸥基因组DNA进行提取，比较电泳结果，观察到酶解10 h时提取样品的清晰度低，条带细，拖尾现象严重，而酶解时间16 h时提取样品的亮度和清晰度明显较高，条带较粗，提示酶解16 h时的DNA提取效果优于酶解10 h，说明在一定时间范围内，蛋白酶K对遗鸥冷冻血液样品处理时间越长，基因组DNA提取效果越好。

［1］郑光美.中国鸟类分类与分布名录［M］.北京:科学出版社，2005，235 －246.

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