根癌农杆菌介导的骏枣愈伤组织遗传转化体系的研究

冯晓东，陈国梁，乔 璟，常海飞

(1.延安大学 生命科学学院;2.陕西省红枣重点实验室，陕西 延安 716000)

枣树分布于我国北方广大地区，一般生长在中温带与寒带过渡带，枣树也是近年来黄河中下游流域退耕还林和发展经济林果的主要树种之一。随着枣产业的发展和市场需求的变化，对枣树品种及其品质特性提出了更多、更高的要求，从而对枣品质育种研究提出了新的目标。利用基因工程方法建立一个完整、稳定的枣树遗传转化系统，不仅可为外源基因的导入奠定技术基础，还可推动品种的定向改良，缩短育种周期，创造出新的优良品种［1］。

植物基因工程育种的前提是建立一种简便、快速、有效的遗传转化系统，以便把外源基因导入受体细胞，进而从转化的细胞中再生出完整的转基因植株，其中农杆菌介导的转基因技术［2，3］是当前枣树新品种培育研究中不可缺少的技术，可将转基因特性传递给后代而无需多代选育，因此具有较大的优势。虽然对根癌农杆菌介导的遗传转化体系的研究已经进行多次改进，但仍存在一些问题，本试验以骏枣的愈伤组织为外植体，筛选适合骏枣愈伤组织诱导和转化的培养基，对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了初步研究，为建立一种稳妥可靠的枣树遗传转化方法提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

取健壮的继代培养14 d骏枣(Zizyphus jujubeMill JunZao)无菌愈伤组织，由延安大学生命科学学院红枣繁育工程重点实验室提供。

1.1.2 工程农杆菌

工程农杆菌菌株(根癌农杆菌LBA4404，携带pART－GF1－2植物表达载体)，该工程农杆菌LBA4404－GF含gbss基因5＇侧翼序列及其驱动的正反向目的片段，其结构如图1所示:

图1 GBSS基因5＇侧翼序列驱动的植物表达干扰载体的构建模式图

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织的预培养

将同一生长状态下的无菌愈伤组织接种到愈伤诱导培养基上进行避光培养，培养基为MS+6－BA0.4 mg/L+2，4－D1.2 mg/L。选取预培养6天，继代14天的愈伤组织进行遗传转化试验。

1.2.2 工程农杆菌的菌悬液制备

从平板上挑取工程农杆菌 LBA4404(含有pART－GF1－2)单菌落，接种于YEP液体培养基中(含 100 mg/LKan、50 mg/LStr)，于恒温 28℃摇床上260 rpm振荡暗培养24～36 h活化。然后将活化好的菌液按1∶50进行放大培养，培养6～8 h，待工程菌生长达到对数生长期，菌活性最大时，倒入无菌离心管中，5000r/min离心5min，收集的菌体用MS液体培养基稀释至 OD600分别为0.2、0.4、0.6、0.8 待用。

1.2.3 卡那霉素选择压的确定

将预培养后的骏枣无菌愈伤组织分别接种到含Kan 浓度为 0、25、50、75、100、125 mg/L 的愈伤诱导培养基上，每处理各水平外植体25个，每次处理重复3次。培养温度28℃，光周期12/d，光强1500～2000 lx，20 d后统计骏枣新愈伤组织的产生率。

1.2.4 愈伤组织的浸染

切取一定数量的、生长健壮骏枣无菌愈伤组织，切成0.5 cm左右的小块，置于工程农杆菌菌液(菌液 OD600值分别为 0.2、0.4、0.6、0.8)中浸染，浸染时间依次为5、10、15 min，取出转化材料，用灭菌滤纸拭去其表面菌液，转入共培养培养基中，于28℃暗处共培养。

1.2.5 浸染外植体的脱菌与筛选

将共培养后外植体转入含250 mg/L头孢霉素，125 mg/L卡那霉素的愈伤诱导培养基中，并在脱菌与抗性筛选的过程中诱导愈伤组织的形成。

1.2.6 CTAB 法提取骏枣愈伤组织 DNA［4－6］

选取抗Kan的愈伤组织0.5 g，用CTAB法提取DNA。

1.2.7 愈伤组织的PCR检测［7－8］

以转化的骏枣愈伤组织DNA为模板，以pART－GF1－2LBA4404菌液作为阳性对照，未经转化的骏枣愈伤组织DNA为阴性对照，水为空白对照，进行PCR扩增。预期扩增片段大小为800 bp，凝胶电泳琼脂糖浓度选择1.2%。

PCR扩增条件如下:预变性(94℃，5 min);变性(94℃，50 s)，退火(50℃，45 s)，延伸(72℃，50 s)，循环30次;最后延伸(72℃，10 min)，4℃保存。

1.2.8 骏枣遗传转化率的初步统计

进行9个批次的遗传转化，每个批次均浸染数十个骏枣外植体，统计浸染、共培养、脱菌与抗性筛选过程中外植体的损失，最后通过CTAB法提取DNA，并由PCR检测鉴定目的基因导入骏枣外植体的结果，计算遗传转化率。

2 结果与分析

2.1 Kan对骏枣愈伤组织再生的影响

从表2中可以看出当愈伤诱导培养基中不含Kan时，愈伤组织再生频率可达90.5%;含Kan 25～75 mg/L时，愈伤组织再生受到抑制;含125 mg/L以上时，几乎完全抑制了愈伤组织的再生;更大浓度时，愈伤组织再生率均为零，而且愈伤组织均迅速褐化死亡，以125mg/LKan作为骏枣愈伤组织的筛选浓度。

2.2 预培养对愈伤组织再生的影响

由表3可以看出，预培养6 d后浸染的骏枣愈伤组织再生频率高于其他处理，表明骏枣愈伤组织预培养后浸染要好于未经过预培养的，且预培养6 d后进行浸染较利于遗传转化。

表1 Kan对骏枣愈伤组织再生的影响

表2 受体材料预培养对愈伤组织再生的影响

2.3 农杆菌液浓度及浸染时间对共培养的影响

从表可以看出看，虽然菌液浓度及浸染时间对共培养的影响不是很大，但以OD600为0.4～0.6的浓度在浸染10 min的条件下比较适宜。

表3 农杆菌菌液浓度与浸染时间对共培养的影响

2.4 骏枣愈伤组织DNA的PCR鉴定结果

图2 以gl－1/gl－6为引物的转基因植株PCR检测

图2显示，浸染过的骏枣愈伤组织1和2出现扩增条带，且与工程菌质粒的扩增条带在同一个水平上，表明工程菌的目的基因已经整合至骏枣愈伤组织的DNA中。

2.5 骏枣遗传转化率的初步统计结果

从表5统计结果看，经PCR检测到目的基因的愈伤组织仅出现在9个批次的3个批次中。试验中共浸染396个愈伤组织，产生了12个卡那霉素抗性愈伤组织，通过对抗性个体的PCR检测验证，只有3个将外源基因转移到了植物的基因组中，其最终转化率仅为0.75%。

表4 骏枣遗传转化率的初步统计

3 小结与讨论

建立高效的组织培养和再生体系是高效遗传转化体系建立的关键因素之一。本试验用骏枣愈伤组织作外植体，与农杆菌共培养，研究了转化过程中影响转化的各种因素，得到了适合骏枣愈伤组织遗传转化的适合条件，初步实现了农杆菌介导的骏枣愈伤组织遗传转化。

3.1 骏枣愈伤组织对Kan选择压的确定

不同植株对同一种类的抗生素敏感程度不同［9－10］，同一种植株的不同器官对同一种类的抗生素敏感程度也不同。试验结果表明骏枣愈伤组织诱导的新愈伤组织对卡那霉素敏感，合适筛选浓度为125 mg/L。

3.2 预培养时间

预培养的目的一方面是使外植体尽快适应新的生长条件，促进细胞分裂，而分裂状态的细胞更容易整合外源DNA，因而可以提高转化效率;另一方面是能减少褐化现象的产生［11］。枣树为木本植物是含酚类物质较多的一类植物，因此采用预培养这一步骤则显得尤为重要。试验表明预培养6 d后进行浸染较利于遗传转化。

3.3 浸染浓度和侵染时间对共培养的影响

在浸染过程中，菌液浓度和浸染时间是两个主要参数。浸染浓度与时间值过小则因外植体上附着的菌体较少而降低农杆菌的浸入，浸染浓度与时间值过大则会对外植体造成伤害，且在后续培养中很难抑制农杆菌而引起污染。当根癌农杆菌浓度在一定范围内，浓度高时适当缩短浸染时间，浓度低时适当延长浸染时间均可以得到较高的转化率［12］。试验表明菌液浓度和浸染时间对共培养影响不大，但以OD600为0.4～0.6的浓度在浸染10 min的条件下比较适宜。试验表明，对于骏枣愈伤组织，共培养16d处理后的愈伤组织诱导效果较好。

最后，本实验经PCR检测，在9个批次中得到了2个批次的转基因植株，初步证明外源目的基因已整合到骏枣基因组中。但遗传转化率较低，最终转化率仅为0.75%。至于建立完善的骏枣遗传转化体系及各参数的量化分析有待进一步的研究。

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