鸭肠炎病毒囊膜糖蛋白gE基因序列分析及真核表达载体的构建

文晶亮，李启红，李俊平，刘 丹，李 岭，杨承槐，李慧姣，夏业才

（中国兽医药品监察所，北京100081）

gE蛋白是疱疹病毒家族中较为重要的糖蛋白之一，由位于US区的US8基因编码。据报道疱疹病毒gE基因是疱疹病毒从视网膜、嗅觉上皮细胞、三叉神经节侵入中枢神经组织所必须的毒力基因，对疱疹病毒在体内毒力表达、侵袭神经核沿着神经传递起着决定性的作用，另外还能促进病毒在细胞之间扩散［1－4］。 目前对人疱疹病毒、伪狂犬病毒、牛疱疹病毒等疱疹病毒糖蛋白gE基因及其编码蛋白已有大量研究［5－7］，而对鸭瘟病毒 gE基因及其编码蛋白尚未有深入的报道。因此，本研究PCR扩增了DEV的gE基因完整开放阅读框（gE）和去信号肽的gE基因（gE’），分别克隆至真核表达载体pCDNA3.1，转染 vero细胞，并应用 RT－PCR 和间接免疫荧光检测gE、gE’蛋白在vero细胞中的转录、表达，旨在探讨gE蛋白在真核细胞中的表达，为gE蛋白的功能研究、鸭瘟抗体检测奠定基础，为深入了解鸭瘟病毒感染的发病机理提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞 鸭肠炎病毒AV1221株，由中国兽医药品监察所菌种保藏中心提供；vero细胞，由本实验室保存；E.coli DH5α感受态细胞，购于天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 真核表达载体 pCDNA3.1，由本实验室保存；pMD18－T载体、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、EcoRⅠ、XhoⅠ、MarkerⅣ、T4 DNA 连接酶，均购自大连宝生物工程有限公司；Lipofectamine 2000，购自 Invitrogen 公司；OPTI－MEM®I培养液，购自gibco®公司；FITC标记的兔抗鸡荧光二抗，购自美国sigma－aldrich公司；DMEM高糖细胞培养液、TBD标准胎牛血清购于赛墨飞世尔生物化学制品有限公司。

1.1.3 试剂盒 高纯度质粒小提中量试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于天根生化科技有限公司。

1.1.4 血清 鸡抗DEV阳性血清，由本实验室制备；TBD标准胎牛血清，购于赛墨飞世尔生物化学制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据已发表的基因组序列，设计扩增鸭肠炎病毒AV1221株的gE基因完整ORF序列（gE）和去信号肽的gE基因（gE’）引物，由invitrogen公司合成。

针对gE的引物：

P1： 5’ －AAGAATTC ATGATGGTTACTTTTAT－3’，下划线部分为酶切位点EcoR I；

P2：5’－AACTCGAGTCAGATGCGGAAACTAGA－3’，下划线部分为酶切位点Xho I；

针对gE’的引物：

P11： 5’－AAGAATTCGACTATCATCAAGTGATT－3’，下划线部分为酶切位点EcoR I；

P22： 5’－AACTCGAGTCAGATGCGGAAACTAGA－3’，下划线部分为酶切位点Xho I；

1.2.2 DNA 模板提取 按参考文献［8］进行。

1.2.3 gE基因的克隆 PCR反应体系：病毒DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，上游引物 P11 μL，下游引物 P21 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.125 μL，ddH2O 16.375 μL，总体积 25 μL。

反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性40 s，46.2 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸 1 min 30 s，30 个循环后，72℃延伸10 min。反应结束后，取3 μL PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 去信号肽 gE 基因（gE’）序列的克隆 PCR

反应体系：病毒 DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，上游引物P111 μL，下游引物 P221 μL，10 ×Ex Taq buffer 2.5 μL，Ex Taq DNA 聚 合 酶 0.125 μL， ddH2O 16.375 μL，总体积 25 μL。

反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性40 s，47℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，30个循环后，72℃延伸10 min。 反应结束后，取3 μL PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.5 gE基因测序及序列分析 PCR产物用胶回收试剂盒回收后，分别连接到pMD18－T载体，转化DH5α，获得重组质粒 pMD18T－gE、pMD18T－ gE’。将酶切及PCR鉴定正确的重组质粒pMD18T－gE、pMD18T－gE’送Invitrogen公司测序，并用生物信息学软件对测序正确的gE基因进行分析，预测gE基因编码蛋白的功能。

1.2.6 真核表达载体的构建 gE基因测序正确后，用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分别双酶切克隆质粒 pMD18－gE、pMD18－gE’和载体 pCDNA3.1。回收、纯化双酶切gE、gE’基因和pCDNA3.1线性质粒，并用T4 DNA连接酶使双酶切gE、gE’基因分别与 pCDNA3.1线性质粒连接，转化 E.coli DH5α 感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’，进行酶切及 PCR 鉴定。

1.2.7 重组表达质粒转染vero细胞 在转染前20 h，消化vero细胞，转入6孔细胞板，每孔6×105个细胞，待细胞铺板密度在75%时进行转染。

Lipofectamine 2000／DNA复合物的制备：分别将 0.8 μg pCDNA3.1－ gE、pCDNA3.1－ gE’质粒分别稀释于不含血清和抗生素的opti－DMEM中，使混合液的终体积均为 50 μL，室温孵育 5 min；2 μL Lipofectamine 2000分别稀释于不含血清和抗生素的opti－DMEM中，使混合液的终体积均为50 μL，轻轻混匀，室温孵育5 min；将50 μL Lipofectamine 2000稀释液分别滴加到50 μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20 min。

转染 vero细胞：分别将 100 μL Lipofectamine 2000／DNA复合物加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4 h，弃去上清，加入10%胎牛血清的M199培养基，置37℃培养24 h后，用1%胎牛血清的M199培养基换液，置37℃培养24 h。

1.2.8 mRNA检测 参照试剂盒操作说明，提取转染后的细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，参照Invitrogen M－MLV反转录酶的说明书操作：模板RNA 5 μL，反转录引物 1 μL，dNTP（10 mmol／L）1 μL，DEPC 水补加至 12 μL，100℃ 水浴 5 min，马上冰淬灭 1 min；短暂离心后加入 5×buffer 4 μL，DTT（0.1mol／L）2 μL，RNA 酶抑制剂 1 μL，轻轻混匀后 50℃水浴5 min；加入 M－MLV反转录酶1 μL，50 ℃水浴 50 min；70 ℃水浴15 min，冰淬灭；加入1 μL RNaseH，马上进行PCR反应。PCR反应参照 1.2.3 和 1.2.4。

1.2.9 表达产物的检测 应用间接免疫荧光法检测表达蛋白，方法如下：取出6孔细胞板，用pH为7.2的PBST溶液漂洗细胞1次，加入0.5 mL预冷的甲醇溶液，固定15 min；弃去甲醇溶液，室温放置2～5 min自然晾干；用PBST洗1次；加入100倍稀释的鸡抗DEV阳性血清，37℃孵育1 h，弃去DEV阳性血清，每孔用含0.05%吐温－20的PBST洗3次后，用PBST液洗2次；加500倍稀释的兔抗鸡荧光抗体，37℃温箱中避光孵育1 h，每孔用含0.05%吐温－20的PBST洗3次后，用PBST洗2次，在荧光显微镜下观察并照相。

2 结 果

2.1 gE基因的 PCR扩增 分别以 gE基因的P1／P2为引物、gE’基因的 P11／P22为引物，病毒 DNA为模板PCR扩增gE、gE’基因，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1400 bp的DNA片段，与预期片段大小相符（图1）。

图1 gE和gE’基因的PCR扩增结果

2.2 gE及gE’基因的克隆及酶切鉴定 回收纯化后的gE、gE’PCR产物与pMD18－T连接，分别构建克隆质粒 pMD18T－gE、pMD18T－gE’，酶切、PCR 结果说明所克隆序列与目的片段大小相近（图2、图 3）。

图2 重组质粒pMD18T－gE酶切及PCR鉴定结果

图3 重组质粒pMD18T－gE’酶切及PCR鉴定结果

2.3 gE基因序列分析及编码蛋白的功能预测

2.3.1 同源性分析结果 用NCBI网站的在线程序BLASTN对鸭瘟AV1221株gE基因序列与国内分离强毒 CHv 株 （GenBank：EU071044.1）、 国 内 疫 苗 株（GenBank：EU082088.2）和德国分离强毒 2085 株（GenBank：JF999965.1）基因序列进行比对，结果表明：鸭瘟AV1221株gE基因序列与国内分离强毒CHv株、国内疫苗株同源性均为100%，与德国分离强毒2085株同源性为99%，143位碱基变异（T－C），导致第48位氨基酸由苏氨酸（T）变成了异亮氨酸（I），此外，412位（G－A）和1351位（C－T）碱基同义突变。

2.3.2 信号肽预测结果 用CBS网站的在线程序SignalP4.1对gE氨基酸序列进行信号肽预测，结果显示：gE蛋白序列中预测到的C值、S值或Y值都大于临界值，推测gE蛋白第1～22位氨基酸为信号肽（图4）。

2.3.3 跨膜区的预测结果 本研究利用 TMHMM 2.0预测鸭瘟AV1221株gE蛋白的跨膜区，其结果显示：gE蛋白在397～419位氨基酸有一个跨膜区，1～396位氨基酸位于胞膜外（胞外区），420～490位氨基酸位于胞膜内（胞质区）（图5）。

图4 gE氨基酸序列推倒肽链信号肽预测结果

图5 gE氨基酸序列推倒肽链跨膜区预测结果

2.4 真核表达质粒的构建及鉴定 重组质粒pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’经 EcoRⅠ及 XhoⅠ双酶切后分别得到约1400 bp和5400 bp的条带，PCR鉴定结果也获得了约1400 bp的条带，说明成功构建了重组真核表达质粒 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’（图 6）。

图6 重组质粒 pcDNA3.1－gE、pcDNA3.1－gE’酶切及PCR鉴定结果

2.5 PCR 鉴定转染结果 提取 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’转染后的 vero 细胞总 RNA，并以提取的细胞总RNA为模板，分别以gE基因的P1／P2、gE’基因的 P11／P22为引物进行 RT－PCR 扩增，得到了相应大小DNA片段（图7），而以提取的空载体pCDNA3.1转染的 vero细胞总 RNA为模板RT－PCR扩增后则未见相应条带，从转录水平上说明gE和gE’基因均在vero细胞获得表达。

图7 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’和 pCDNA3.1转染vero细胞RT－PCR结果

2.6 表达产物的免疫荧光鉴定 转染48h后，经用荧光显微镜观察，只有重组质粒pCDNA3.1－gE’转染的 vero细胞可见绿色荧光（图 8 A），而pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1 转染的 vero 细胞中未见明显荧光（图8B，C），结果表明gE’基因在vero细胞中获得了正确表达，具有免疫原性，能与抗体结合。

图8 真核表达载体转染vero细胞后间接免疫荧光检测结果

3 讨论与小结

本研究结果表明，鸭肠炎病毒AV1221株 gE基因完整的开放阅读框长为1473 bp，共编码490个氨基酸，其中第1～22位氨基酸为信号肽序列。其基因序列与国内分离强毒CHv株［9］、国内疫苗株［10］和德国分离强毒 2085 株［11］均具有较高同源性，说明鸭肠炎病毒AV1221株gE比较保守。而软件TMHMM 2.0预测表明gE蛋白是典型的囊膜糖蛋白，包括较长的胞外区（396个氨基酸）、跨膜区（23个氨基酸）和胞质区（71个氨基酸），这与常华［12］结果一致。

疱疹病毒gE蛋白表达载体的构建及表达是其功能研究的重要方面，Zhu等［13］将VZV gE构建在真核表达质粒pSVK3上，转染COS－7细胞，用间接免疫荧光方法检测到VZV gE蛋白在COS－7细胞中表达并定位于COS－7细胞的高尔基体。常华［12］利用间接免疫荧光方法检测到DEV gE蛋白可在感染鸭胚成纤维细胞的胞浆中表达。在本研究中，含信号肽的表达载体pCDNA3.1－gE在vero细胞内完成了转录过程，但却未能在vero细胞内检测到荧光，与上述研究结果并不一致，推测可能与所用毒株、宿主细胞不同以及存在信号肽有关。因此又构建了去信号肽的真核表达载体pCDNA3.1－gE’，转染vero细胞后完成了转录过程，并进行了表达，证实gE自身所具有的信号肽序列可以有效诱导gE蛋白分泌到细胞外，与软件TMHMM 2.0预测结果一致。实验表明，在真核表达体系中，信号肽的有无对gE蛋白的表达具有显著的影响。

本研究通过酶切和PCR方法证实，成功构建了真核表达质粒 pCDNA3.1－gE 和 pCDNA3.1－gE’，并在转录水平和蛋白水平上检测了pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’在 vero细胞中的表达，下一步将通过G418抗生素筛选稳定表达gE的vero细胞系，为gE蛋白的体外表达、功能研究、鸭瘟抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。

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