乌司他丁注射液改善急性肺损伤兔循环内皮祖细胞成血管能力及对PKB／eNOS／NO 通路的影响

王海峰，郭伟新，谢南姿，李 健，沈 艺

急性肺损伤时内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）参与到肺泡－毛细血管的修复，2008 年内皮祖细胞移植至油酸诱导的急性肺损伤兔模型［1］的研究已证实在急性肺损时内皮祖细胞可归巢到肺毛细血管，起到修复肺损伤的作用。乌司他丁注射液（ulinastatin injection，UTI）减轻急性肺损伤程度，现有的研究认为乌司他丁可减轻肺部炎症，减少炎症细胞浸润及炎症因子释放［2－4］。乌司他丁是否引起肺泡毛细血管内皮改变现暂无研究。PKB／eNOS／NO 通路在内皮祖细胞的成血管能力及归巢有着重要作用［5］，并且最新的研究表明乌司他丁可引起AKT 表达上升［6］，但未进行下游通路的研究，为此，本课题进行乌司他丁是否作用于该通路进一步研究，观察乌司他丁注射液对急性肺损伤循环内皮祖细胞血管生成能力及对PKB／eNOS／NO 通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年新西兰大耳白兔（2.5kg～3.0 kg）共50只（购自广东省动物中心），均为雄性，根据国家实验动物健康使用规范指南饲养，所有操作符合广东省人民医院伦理委员会的要求。

1.2 材料与试剂 M199培养液、胎牛血清购自Hyclone公司；人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；体外血管形成试剂盒、DIL－labeled acetylated LDL（Dil－acLDL）、FITC 标记荆豆凝集素Ⅰ（FITCUEA－1）、Oleicacid（75mg／kg）均购自Sigma公司；NO检测试剂盒（武汉博士德），乌司他丁注射液（天普洛安）。

1.3 方法

1.3.1 分组方法 体外细胞实验共分为5组，每组8只。对照组：抽取10mL外周血分离诱导内皮祖细胞7d后，行内皮祖细胞鉴定。48h 后，检测成血管能力，NO、PKB、eNOS 蛋白表达水平。急性肺损伤组：造模成功24h后，抽取10mL 外周血，分离诱导内皮祖细胞，48h后，检测成血管能力，NO、PKB、eNOS蛋白表达水平。乌司他丁治疗组：造模成功24h后，抽取10mL外周血，分离诱导内皮祖细胞。内皮祖细胞加入1 000U／mL乌司他丁培养48h后，检测成血管能力，NO、PKB、eNOS 蛋白表达水平。乌司他丁＋PKB阻断剂（LY－294002）组：造模成功24h 后，抽取10mL 外周血，分离诱导内皮祖细胞。内皮祖细胞加入1 000U／mL乌司他丁及LY－294002（5μmol／L）培养48h后，检测成血管能力，NO、PKB、eNOS蛋白表达水平。乌司他丁＋eNOS 阻断剂（L－NAME）组：造模成功24h后，抽取10mL 外周血，分离诱导内皮祖细胞。内皮祖细胞加入1 000 U／mL 乌司他丁及LAME（1×104μmol／mL）培养48h后，检测成血管能力，NO、PKB、eNOS蛋白表达水平。

1.3.2 EPCs的分离培养 肝素抗凝取骨髓10mL，采用密度梯度离心法获取单个核细胞，接种在24孔板上。应用M199培养基（含20%胎牛血清，青霉素100 U／mL，链霉素100 U／mL）培养，培养4d 换液，用PBS洗去非贴壁细胞。换培养液后培养至7d，PBS液去除非贴壁细胞，对贴壁细胞进行细胞鉴定。

1.3.3 EPCs的鉴定 按2×106～3×106接种在纤连蛋白包被24孔板，细胞玻片培养第4天取出，将细胞与2.4ng／mL的DIL－acLDL在37℃下孵育1h，以检测EPCs摄取DIL－acLDL。采用2%多聚甲醛固定细胞10 min。应 用PBS 清 洗2 min，10ng／mL 的FITC－UEA－1加于上述标本，37 ℃下孵育1h。采用激光共聚焦显微镜鉴定DIL－acLDL 和FITC－UEA－1双染色阳性细胞被认为是正在分化的内皮祖细胞。

1.3.4 EPCs血管生成能力检测 采用体外血管生成试剂盒检测体外EPCs的血管生成能力。200倍倒置显微镜下观察小血管生成情况。细胞拉长变形，长度为宽度的4倍以上即可被认为形成小管。选择200倍光镜下5个视野，计数小管数。

1.3.5 Western Blot检测PKB、eNOS、VEGF 蛋白表达水平 按照参考文献和本室已经建立的常规方法进行。PKB、eNOS、VEGF 各种分子抗体均可通过商业化购买获得（Cell Signaling Technology公司。垂直电泳分离蛋白，对于小分子量蛋白采用半干转（Bio－RAD 半干转仪），而大分子蛋白采用湿转，将蛋白转至PVDF膜上，相应一抗4 ℃摇床孵育过夜，使用对应二抗孵育2h，PBS冲洗后ECL 化学发光法曝光感光底片，显影定影洗涤，扫描底片经过Band Scan图像分析软件半定量分析目的蛋白条带。

1.3.6 采用硝酸还原酶法测定培养液上清NO 的含量 NO 化学性质活泼，在体内代谢很快转化为硝酸盐（NO3－）和亚硝酸盐（NO2－），而NO2－进一步转化为NO3－，利用硝酸还原酶特异性将NO3－还原为NO2－，通过显色深浅测其浓度的高低。测定方法按照一氧化氮测定试剂盒说明书来操作。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，数据用均数±标准差）表示，组间比较采用方差分析。

2 结 果

2.1 内皮祖细胞鉴定 共聚焦显微镜观察EPCs摄取荧光双染阳性×200DiL－acLDL 染色细胞呈红色；FITC－UEA－I染色细胞呈绿色；双染色细胞同时呈红、绿色。通过共聚焦显微镜鉴定，FITC－UEA－I和DiLacLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。

2.2 体外EPCs血管生成能力比较 急性肺损伤组较正常对照组体外成血管数目下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）；乌司他丁治疗组较急性肺损伤组体外成血管数目增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）；乌司他丁＋LY294002组、乌司他丁＋L－NAME 组较乌司他丁治疗组体外成血管能力下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）。详见表1。

表1 各组体外成血管数目比较

表1 各组体外成血管数目比较

与正常对照组比较，1）P ＜0.05；与乌司他丁治疗组比较，2）P ＜0.05。

组别 n 血管数目正急常性对肺照损组伤组66 6467..8333±±35..534 51）2）乌司他丁治疗组 6 61.67±7.06乌乌司司他他丁丁＋＋LLYN29A4M00E2组组 66 3393..5607±±183.9.2671）12））2）

2.3 PKB、eNOS蛋白表达比较 急性肺损伤组较正常对照组PKB、eNOS表达增加，但差异无统计学意义（P ＞0.05）；乌司他丁治疗组较急性肺损伤组PKB、eNOS蛋白表达上升，差异有统计学意义（P ＜0.05）；乌司他丁＋LY294002 组、乌司他丁＋L－NAME 组PKB、eNOS蛋白表达较乌司他丁治疗组下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）。详见表2。

表2 各组PKB、eNOS蛋白表达比较

表2 各组PKB、eNOS蛋白表达比较

与正常对照组比较，1）P ＜0.05；与乌司他丁治疗组比较，2）P ＜0.05。

组别 n PKB eNOS正常对照组 6 0.10±0.05 0.04±0.01急性肺损伤组 6 0.38±0.072） 0.05±0.012）乌司他丁治疗组 6 0.64±0.081） 0.18±0.151）乌司他丁＋LY294002组 6 0.31±0.092） 0.06±0.01）2）乌司他丁＋L－NAME组 6 0.09±0.022） 0.05±0.01）2）

2.4 NO 含量比较 乌司他丁治疗组较急性肺损伤组NO 浓度上升，差异有统计学意义（P ＜0.05）；乌司他丁＋LY294002组、乌司他丁＋L－NAME 组较乌司他丁治疗组NO 浓度下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）。详见表3。

表3 各组NO 含量比较 μmol／L

表3 各组NO 含量比较 μmol／L

与正常对照组比较，1）P ＜0.05；与乌司他丁治疗组比较，2）P ＜0.05。

组别 n NO正常对照组 5 6.64±0.47急乌乌乌性司司司肺他他他损丁丁丁伤治＋＋LL组疗Y－N 组29 A 4M0 0E2组组 5555 7954....4345 8644±±±±0100....8256 4328 2122））））

3 讨 论

通过体外细胞培养直接观察乌司他丁对内皮祖细胞的功能影响。内皮祖细胞的迁移、分化，最终是用于内皮修复及血管新生，而内皮祖细胞的成血管能力是以上功能的综合反映，更能体现内皮祖细胞功能。本研究选择内皮祖细胞的成血管能力作为观察指标，发现经乌司他丁干预后，兔循环内皮祖细胞体外成血管的能力较急性肺损伤组细胞成血管功能上升。

在体外进行细胞培养同样发现乌司他丁组治疗后内皮祖细胞的成血管能力提高，并且这种能力的提高可以被PKB、eNOS阻断剂阻断。因此，认为乌司他丁作用于内皮祖细胞，导致内皮功能改善，修复肺泡毛细血管屏障，减少肺部渗出，其机制可能有PKB／eNOS／NO 通路参与。

乌司他丁改善内皮祖细胞成血管功能的机制是因为其减轻炎症因子表达和炎症细胞浸润导致内皮保护，还是通过其他途径导致内皮祖细胞功能改善这是本课题解决的问题。已有研究表明PKB／eNOS／NO通路是调节内皮祖细胞生物学功能的重要信号途径，多种细胞因子、药物通过此信号通路作用于内皮祖细胞的归巢、分化［7］。乌司他丁是否通过PKB／eNOS／NO 通路改善内皮祖细胞功能？

本实验在动物模型中观察到急性肺损伤肺组织PKB、eNOS减少，经乌司他丁治疗后兔肺组织PKB、eNOS表达上升。在体外培养的血管内皮祖细胞检测也有同样的趋势。NO 是PKB／eNOS的下游产物，可直接介导内皮祖细胞功能提高［8，9］。本实验结果可见在乌司他丁治疗后内皮祖细胞NO 上升，经L－NAME、LY294002 阻 断 剂 后NO 含 量 下 降。在 体外成血管结果中发现内皮祖细胞的成血管功能在乌司他丁治疗后明显提高与NO 的变化一致。在本研究中急性肺损伤时NO 较正常对照组升高，但差异无统计学意义，经乌司他丁治疗后这种趋势增加，与正常对照组比较差异有统计学意义。在急性肺损伤时大量的炎症因子分泌造成内皮祖细胞损伤，这种损伤导致内皮功能下调，经治疗可有效改善，在本研究中表现为经乌司他丁治疗后内皮祖细胞成血管功能明显上调。在本研究中使用了PKB阻断剂（LY294002）与eNOS阻断剂（L－NAME），经乌司他丁治疗后NO 及成血管能力提高，给予PKB阻断剂后NO 和成血管能力下降，考虑为乌司他丁直接作用于PKB 或PKB 以上的通路，最新的研究也证明乌司他丁可引起PKB表达上升［6］。

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