北疆地区4个规模化白羽肉鸡养殖场H9亚型禽流感血清抗体监测

齐向涛 许 追 欧 都 许丹丹 杨 莉 齐亚银 （新疆石河子大学动物科技学院 新疆 石河子 832000)

H9亚型属于低致病性禽流感病毒,主要侵害鸡的呼吸系统,如果肉禽饲养场发生本病,易继发大肠杆菌病等疾病，造成较高的死淘率。目前国内禽流感H9亚型属于非强制性免疫范围,为了防止禽流感H9亚型病毒感染带来严重的经济损失,免疫控制是最经济、最有效的措施。商品代肉鸡饲养周期短,短期内疫苗免疫的次数和种类较多,制定合理有效的免疫程序非常重要。本研究拟检测本地区规模肉鸡场其H9亚型抗体效价，抗体进行跟踪监测,以期找出免疫抗体的消长规律和确定最佳的免疫时间,为制订的免疫程序提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 药品

1%鸡红细胞液，新城疫-H9禽流感二联苗，H9亚型A I V诊断抗原，阿氏液，PBS液。

1.2 试验仪器

U型或V型微量反应板、微量移液器、枪头。

1.3 1%鸡红细胞液的制备

用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡，采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。

将离心管中的血液经1500～1800r/min离心8min，弃上清液，沉淀物加入pH 7.2，0.01mol/LPBS液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，第三次洗涤，轻轻混合后，再经1500～1800 r/min离心10分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的PBS，用吸管反复吹吸使PBS与红细胞混合均匀。取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1m L，加入9m LPBS，混合均匀即可。

1.4 血样的采集和血清的制备

从4个实验基地，随机各选取一栋鸡舍，分别对7、14、21、28日龄及出栏的商品鸡群采取翅下静脉采血，每栋抽血样30份，共采血样600份，对血样分离血清共480份，分离的血清置-20℃保存待检。这些基地的鸡群，在1日龄时进行H9亚型禽流感灭活疫苗免疫。

1.5 H I实验

1.5.1 血凝实验

（1）取96孔反应板1块置于水平实验台上在第1排1～12孔内加入25μL生理盐水。

（2）在第1孔内加入H9亚型A I V诊断抗原25μL混匀后吸出25μL加入第2孔内再混匀后吸出25μL加入第3孔内，依此类推至第11孔时弃掉25μL，第12孔不加作对照孔。

（3）在1～12孔均加入25μL1%的鸡红细胞悬液。

（4）震荡后室温下放置30min后依次观察结果。

1.5.2 血凝抑制实验

（1）配置4单位抗原。

（2）在1～12孔内加入25μL生理盐水。

（3）在第1孔内加入H9亚型AIV抗血清25μL，混匀后吸出25μL加入第2孔内，再混匀后吸出25μL加入第3孔内，依此类推至第11孔时弃掉25μL，第12孔不加血清作为抗原对照孔。

（4）在1～10孔内均加入H9亚型流感病毒4单位抗原25μL，第11孔加入SPF鸡血清做阴性对照孔，第12孔加生理盐水25μL作空白对照孔。震荡后室温静止作用5min。

（5）在1～12孔内均加入1%鸡红细胞悬液25μL震荡，室温下放30min后依次观察结果。

1.5.3 结果判定依据

以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的H I效价。当阳性对照血清的H I效价与已知效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清效价不高于1log2时，试验方可成立。被检血清H I效价≤3log2判为阴性；＝4log2判为可疑；≥5log2判为阳性。

2 数据处理与统计分析

用EXCEL软件进行原始数据处理，用SPSS11.5对试验数据进行方差分析。求效价平均值、离散度。

2.1 7日龄抗体效价

通过试验测定肉仔鸡的母源抗体滴度在7日龄时相对不高但整齐均匀，7日龄的效价主要集中在4～6log2之间，通过计算1～4基地的离散度对比可知，抗体效价整体比较集中，平均值为5 l o g2（见表1）。

2.2 14日龄抗体效价

14日龄肉仔鸡的母源抗体较7日龄时下降很多，在2log2左右，平均值为2.1log2，表明1～14之间肉仔母源抗体下降速度较快，并且抗体效价较低，离散度比较高，表明各个鸡群的机体差异较大（见表2）。

表1 7日龄抗体效价

表2 14日龄抗体效价

表3 21日龄抗体效价

表4 28日龄抗体效价

表5 出栏时抗体效价

2.3 21日龄抗体效价

同7日龄和14日龄相比，21日龄的鸡群抗体效价已经处在一个较低的水平，在此阶段以及前后几天，鸡群对H9亚型流感病毒处于易感期（见表3）。

2.4 28日龄抗体效价

同21日龄相比，此日龄的抗体滴度明显升高，表明免疫后集体已经开始产生免疫应答，从离散度上看，离散度较21日龄小，4log2以下的比例相对较多（见表4）。

2.5 出栏时抗体效价

此阶段，抗体滴度已经处于一个相对高的水平，基本处于7log2水平，从离散度水平可知，抗体效价整体比较高且集中。说明鸡群整体免疫效果理想，但仍有个别鸡群抗体效价较低。其原因可能是部分鸡群机体体质差，个别漏免，或免疫失败，同时与鸡群所处环境差异有关（见表5）。

3 结果与讨论

3.1 白羽肉鸡养鸡场H9亚型禽流感病毒的防制措施（见表6）。

表6 白羽肉鸡养殖场的免疫程序

3.2 免疫程序的评价分析

由图1可知，该免疫程序合理，但整体水平较好，现有的免疫程序产生的抗体可以满足生产需求。

实验结果表明，对肉仔鸡而言，抗体水平一般在5～7天H I抗体平均水平为4～5 l o g2，在14天左右H I水平平均在2 l o g2，42天左右H I水平平均在6～8 l o g2之间，且分布在0～10之间，均匀度较差，肉仔鸡在20天前有母源抗体的存在可以一定程度上抵抗外来病毒的感染，在20～28天母抗体降至最低（平均H I在1～2 l o g2左右），所以此阶段为危险期。根据试验和饲养实践总结，对肉仔鸡而言，重点应落实一个“防”字，本着一个“早发现早治”的原则，在预防方面着重从以下几个方面做好工作。

图1 不同日龄H9亚型禽流感抗体效价

（1）做好场区清理、净化和隔离工作，确保场区内无H9亚型禽流感病毒的存在，确保所有进场的车辆、人员、物品都是安全的，确保携有病毒的人员和物品与鸡群彻底隔开。

（2）做好各项免疫，确保鸡群有较好的抗病力。

（3）做好药物的预防工作，制订合理的投药计划，有计划有目的用药，制订适合肉鸡的药物预防计划，药品可以自主选择，把握好用药时间和阶段。

（4）加强饲养管理，减少鸡群各种应激。

4 结论

对本地区规模化商品代白羽肉鸡养殖场11日龄免疫前后鸡群的H9亚型禽流感H I抗体的消长规律进行调查可知：H9亚型H I抗体滴度在11日龄前离散度较小，抗体滴度趋于集中，均匀度较好，11日龄免疫后个体H9亚型H I抗体滴度均匀度较差，尤其在21日龄时，这可能与IBD等免疫对H9免疫有一定的影响有关。