拉米夫定和阿德福韦酯抗乙型肝炎病毒耐药位点检测及临床意义

贾德兴，冯静，李萍，伦秀英，于贤杰

·病毒性肝炎·

拉米夫定和阿德福韦酯抗乙型肝炎病毒耐药位点检测及临床意义

贾德兴，冯静，李萍，伦秀英，于贤杰

目的对应用拉米夫定或阿德福韦酯治疗后耐药的慢性乙型肝炎患者给予联合治疗，观察治疗前后乙型肝炎病毒（HBV）变异模式的变化及对疗效的影响。方法在142例对拉米夫定耐药患者中，给予72例拉米夫定联合阿德福韦酯、70例给予恩替卡韦联合阿德福韦酯冶疗，在72例对阿德福韦酯耐药患者中，给予36例联合拉米夫定、另36例联合恩替卡韦治疗，各组均治疗48 w，测定和比较治疗前后所有患者HBV DNA聚合酶逆转录区相关变异位点变化。结果在拉米夫定初治发生耐药的患者中，发生M204V和IL180M变异率分别为98.6%（140/142）和56.3%（80/142），接受拉米夫定联合阿德福韦酯治疗患者HBV DNA阴转率为86.1%，与恩替卡韦联合阿德福韦酯治疗患者（97.1%）比，无显著性差异；在阿德福韦酯初治发生耐药的患者中，A181V和N236T变异频率分别为63.9%（46/72）和52.8%（38/72），接受阿德福韦酯联合拉米夫定治疗患者HBV DNA阴转率为52.8%，显著低于阿德福韦酯联合恩替卡韦组（77.8%，P＜0.05）；在阿德福韦酯联合拉米夫定治疗的36例患者中，19例（52.8%）HBV DNA阴转，在阿德福韦酯联合恩替卡韦治疗的36例患者中，28例（77.8%）患者HBV DNA阴转，差异具有显著性（x2＝4.963，P＜0.05）。结论以rtM204变异为主的拉米夫定耐药在联合阿德福韦酯进行挽救治疗后疗效确定；以rtA181变异为主的阿德福韦酯耐药患者在接受阿德福韦酯联合恩替卡韦治疗后的疗效优于联合拉米夫定。

慢性乙型肝炎；拉米夫定；阿德福韦酯；耐药；挽救治疗

在应用核苷（酸）类药物过程中，如发生病毒耐药，挽救治疗多采取联合应用另一种无交叉耐药的抗病毒药物。我们在142例应用拉米夫定和72例应用阿德福韦酯初始治疗耐药的慢性乙型肝炎患者，检测了治疗前后其耐药模式的变化及其对疗效的影响。

1 资料与方法

1.1 病例来源自2009年9月～2012年12月我院就诊或住院的慢性乙型肝炎患者214例，诊断符合2005年发布的《慢性乙型肝炎防治指南》的标准。其中142例为初次接受拉米夫定抗病毒治疗发生耐药的患者，男115例，女27例；年龄为（33.9± 12.1）岁；72例为初次接受阿德福韦酯抗病毒治疗发生耐药的患者，男52例，女20例；年龄为（43.1± 15.7）岁。

1.2 治疗方法142例初次接受拉米夫定（葛兰素史克公司）100 mg/d抗病毒治疗，发生耐药的平均时间为（42±19）w。将患者随机分为两组，1组给予拉米夫定联合阿德福韦酯（葛兰素史克公司）10 mg/d治疗，另1组换用恩替卡韦（施贵宝公司）0.5 mg/d，联合阿德福韦酯治疗，共48 w；72例初次接受阿德福韦酯（葛兰素史克公司）10 mg/d抗病毒治疗，发生耐药的平均时间为（74±21）w。将患者随机分为两组，1组给予阿德福韦酯联合拉米夫定（葛兰素史克公司）治疗，另1组给予阿德福韦酯联合恩替卡韦（施贵宝公司）治疗，共48 w。

1.3 血清HBV DNA定量检测采用荧光定量聚合酶链反应法检测（美国ABI公司PE-5700荧光定量PCR扩增仪和深圳匹基公司试剂盒）。

1.4 HBV P区耐药位点测序采用套式PCR法扩增特异性HBV基因片段（BIO-RAD系列S1000 Thermal Cycler定性PCR仪，使用上海复星公司提供的HBV DNA提取试剂盒）。采用焦磷酸测序法进行核苷酸序列测定，分析P区耐药（PyroMark Q96 ID测序仪，PyroMark Gold Q96 Reagents焦磷酸测序试剂盒）。共检测11个位点变异，即rtL180M、rtM204V/I、rtV173L、rtI169T、rtS202G（V/C/ I）、rtM250V（L/I）、rtA181V/T、rtN236T、rtT184A（G/I/ S/L/F）、rtA194T/M和rtI233V。

1.5 统计学方法应用SPSS13.0统计软件，两组间均数差异的比较采用两独立样本t检验，计数资料采用x2检验及Fisher确切概率法，P＜0.05为具有显著性差异。

2 结果

2.1 基线特征拉米夫定初治耐药和阿德福韦酯初治耐药患者基线资料见表1和表2。

表1 拉米夫定初治耐药患者基线资料（±s）

表1 拉米夫定初治耐药患者基线资料（±s）

例数年龄（岁）ALT（U/L）HBV DNA（lg copies/ml）拉米夫定联合阿德福韦酯7233.1±12.767.1±40.55.4±0.9恩替卡韦联合阿德福韦酯7033.5±9.873.8±57.05.3±1.0

表2 阿德福韦酯初治耐药患者基线资料（±s）

表2 阿德福韦酯初治耐药患者基线资料（±s）

例数年龄（岁）ALT（U/L）HBV DNA（lg copies/ml）阿德福韦酯联合拉米夫定3642.5±18.345.8±28.04.3±0.9阿德福韦酯联合恩替卡韦3639.7±20.150.5±31.74.3±0.7

2.2 初始治疗发生耐药后的变异模式初始应用拉米夫定耐药后，M204V/I变异频率为98.6%（140/142），L180M为56.3%（80/142），V173L为16.9%（24/142），A181V为2.8%（4/142），N236T为2.8%（4/142），T184G为5.6%（8/142），S202G为5.6%（8/142）。以M204V/I和M204V＋L180 M为主。存在部分恩替卡韦耐药变异；初始应用阿德福韦酯耐药后，A181V变异频率为63.9%（46/72），N236T为52.8%（38/72），A181T为8.3%（6/72），L180 M为16.7（12/72），见表3。

2.3 耐药后联合治疗的疗效在治疗48 w，在拉米夫定联合阿德福韦酯治疗的72例患者中，62例（86.1%）HBV DNA阴转，在70例恩替卡韦联合阿德福韦酯治疗的患者中，68例（97.1%）HBV DNA阴转（x2＝2.099，P＞0.05）；对所有患者再次进行P区耐药测序。结果显示，在两组患者中，治疗前存在M204V、M204I、M204V＋L180M＋V173L、L180 M和M204V＋V173L变异的76例患者HBV DNA均阴转，病毒变异位点消失。在拉米夫定联合阿德福韦酯治疗的患者中，在存在M204V/L180M变异的25例患者中，5例HBV DNA未阴转，其中4例变异模式未发生改变，另1例改变为A181T/M204V/L180 M/V173L变异。在4例M204V/L180 M/S202G变异者中，2例HBV DNA未阴转，在4例M204V/ T184G/L180M变异者中，3例HBV DNA未阴转，变异模式也未发生改变；在恩替卡韦联合阿德福韦酯治疗的70例患者，4例M204V/T184G/L180M变异患者中，2例HBV DNA未阴转，其中1例改变为M204V/L180M/T184G/I/A181T变异；在治疗48 w，在阿德福韦酯联合拉米夫定治疗的36例患者中，19例（52.8%）HBV DNA阴转，在阿德福韦酯联合恩替卡韦治疗的36例患者中，28例（77.8%）患者HBV DNA阴转，差异具有显著性（x2＝4.963，P＜0.05）。在36例阿德福韦酯联合拉米夫定治疗的患者中，治疗前9例存在A181V/N236T和A181T/ N236T变异患者HBV DNA均未阴转，变异模式也未发生改变。在17例A181V变异患者中，有9例HBV DNA阴转，其中1例未阴转患者出现A181V/ M204V/L180 M变异。在36例阿德福韦酯联合恩替卡韦治疗的患者，6例存在A181V/N236T变异患者中，5例HBV DNA未阴转，在3例A181T/N236T变异患者中，HBV DNA均未阴转，变异模式也未发生改变。

表3 初始治疗发生耐药后的变异模式

3 讨论

核苷（酸）类似物已成为继干扰素α（IFN-α）之后的又一类用于抗HBV治疗的有效药物。大多数接受核苷（酸）类似物治疗的患者难以通过短期治疗实现持久应答，而需要接受长期治疗，这必将增加病毒耐药的风险。随着核苷（酸）类似物种类的增加，HBV耐药变异的复杂性也大大增加。HBV侵入人体后，与靶细胞膜上的受体结合，脱去包膜，进入细胞质中，脱去核衣壳，部分双链环状HBV DNA进入靶细胞核中，在DNA聚合酶作用下，以负链DNA为模板，延长正链，修补裂隙区，形成共价闭合环状DNA（cccDNA）。HBV DNA的复制首先以cccDNA为模板，在宿主RNA聚合酶的作用下，转录成3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb等大小不同的HBV mRNA，部分3.5kb的HBV mRNA作为前基因组RNA，在HBV逆转录酶的作用下，逆转录为负链DNA，再以此为模板，在HBV聚合酶的作用下合成正链DNA，形成子代病毒的部分双链HBV DNA。其他的HBV mRNA在细胞浆中翻译成病毒的各种蛋白成分，并与子代HBV DNA装配成完整的病毒颗粒，释放至细胞外。部分子代HBV DNA进入靶细胞核中，补充cccDNA池，并继续复制，周而复始。慢性HBV感染者肝细胞核中的cccDNA半寿期长，而现有核苷（酸）类似物对于cccDNA均无直接作用，这也是多数患者需用核苷（酸）类似物长期治疗的原因之一。

HBV每24 h可复制1×1012～1013拷贝。HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA-DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA-RNA-DNA的复制过程。在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，由于HBV逆转录酶缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，介于其他DNA病毒和RNA病毒之间，大约为1/105。HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别，因此，每一个患者体内的病毒都是由存在基因序列差异的病毒株组成的动态变化的病毒群，即HBV以准种（quasispecies）的形式存在。

HBV病毒群的演变也符合达尔文进化论的规律。有些位点的变异，可能是致死性的，发生这种变异的HBV不能存活。有些位点的变异对其复制能力没有显著影响，但很多位点变异导致子代病毒复制能力降低或增强。不同基因序列的病毒株在病毒群中所占的相对比例，一方面取决于病毒株自身的复制能力，另一方面也受到机体免疫系统或药物的选择性压力的影响。

核苷（酸）类似物进入机体后，形成三磷酸活性成分，与机体天然的脱氧三磷酸核苷（dNTP）竞争性结合到HBV聚合酶上。但由于三磷酸化的核苷（酸）类似物不具备天然的dNTP结构，而使HBV的DNA链合成终止，从而抑制HBV复制。但如果患者体内的HBV序列发生变异，导致产生的HBV聚合酶与核苷（酸）类似物结合力降低，那么变异的HBV即不受核苷（酸）类似物的抑制或抑制能力下降。因此，在继续应用核苷类似物治疗的情况下，野生株病毒因对核苷（酸）类似物敏感而继续被抑制；变异株病毒因具备一定的复制能力，而且对核苷（酸）类似物不敏感而逐渐替代野生株，成为体内HBV的优势株，从而导致患者对于核苷（酸）类似物的耐药。

核苷类药物的耐药及管理是慢性乙型肝炎诊治中十分重要的问题。一旦发生耐药，导致疾病进展（如病毒学反弹、生化学突破、肝炎复燃、肝脏失代偿甚至肝衰竭），耐药患者肝硬化和肝癌发生率增高，耐药可使已取得的组织学改善逆转，耐药病毒株的传播可能导致公共卫生问题，耐药突变可导致S基因突变，产生免疫逃逸株，既能感染未接种乙肝疫苗者，也可感染已接种乙肝疫苗者，耐药使后续治疗方案变得更为复杂和困难；耐药将增加长期治疗的医疗成本。近年来，我国、亚太、欧洲和美国肝病学会对慢性乙型肝炎诊疗指南及共识不断地更新[1～6]，指导临床医生进行有效的耐药管理，以期达到降低疾病进展风险、改善预后、降低治疗成本的目的。

拉米夫定应用广泛，但其耐药率高。对于初治的慢性乙型肝炎患者，拉米夫定1～5年耐药率可由14%升至70%[7～9]。拉米夫定耐药的主要变异位点为HBV聚合酶区rtM204V/I/S，并可伴有L180M、V173L等位点的代偿变异[10，11]。也有报道拉米夫定耐药后筛选出对其它核苷类药物的耐药变异[12，13]。针对拉米夫定耐药曾一度选择序贯阿德福韦酯或恩替卡韦挽救治疗，但此后发现序贯治疗增加了多重耐药的发生[14，15]。本研究发现在未应用阿德福韦酯之前，在拉米夫定耐药患者中已出现拉米夫定与恩替卡韦的双重耐药变异，变异模式为M204V＋L180 M＋S202G、M204V＋T184G＋L180M。给予耐药患者联合阿德福韦酯或换用恩替卡韦联合阿德福韦酯治疗48周后，2组患者HBV DNA阴转率无显著性差异。但值得注意的是，在拉米夫定联合阿德福韦酯组中，不应答的患者出现对拉米夫定及阿德福韦酯的双重耐药，而在恩替卡韦联合阿德福韦酯组中，不应答的患者出现对拉米夫定、阿德福韦酯及恩替卡韦的多重耐药。阿德福韦酯耐药的主要变异位点为rtA181V/T和rtN236T，而rt181位点突变较rt236多见。

体外实验表明，rtA181V/T变异对拉米夫定敏感性下降，对阿德福韦酯敏感性也显著下降；rtA181V+rtN236T对拉米夫定敏感性下降35～43倍，对阿德福韦酯敏感性下降18倍[16，17]；而单一rtN236T变异对拉米夫定敏感，对阿德福韦酯敏感性显著下降[18]。2009年欧洲肝病学会CHB诊疗指南提示，rtA181耐药株对恩替卡韦和替比夫定敏感[19]。韩国学者Cho et al报道，对阿德福韦酯耐药的慢性乙型肝炎患者存在rtA181V/T突变，应用阿德福韦酯联合恩替卡韦治疗，治疗12个月时病毒学应答率为95.8%[20]。国内也有研究证实应用阿德福韦酯出现rtA181耐药时加用或换用恩替卡韦的疗效好于加用替比夫定[21]。我们对初始阿德福韦酯治疗发生耐药的患者给予联合恩替卡韦或联合拉米夫定治疗，发现联合恩替卡韦的疗效的确优于联合拉米夫定，未发现不应答的患者出现广泛的耐药位点。

目前，在我国慢性乙型肝炎初治的患者中，应用核苷类药物抗病毒治疗仍以低效、高耐药的药物为主，因可出现不应答，被迫挽救治疗，联合或序贯应用多种核苷类药物，可出现针对多种药物的耐药突变。如何尽可能地避免多重耐药的发生，我们认为对服用核苷类药物出现耐药的患者，应尽可能检测所有相关的变异位点，而不应局限于已服用药物的变异位点。根据检测结果调整治疗方案以提高疗效。以rtM204变异为主的拉米夫定耐药，联合阿德福韦酯进行挽救治疗疗效确定，如换用恩替卡韦联合阿德福韦酯，未能增加疗效，且产生更为复杂而难以处理的耐药模式。以rtA181变异为主的阿德福韦酯耐药，联合恩替卡韦的疗效优于联合拉米夫定。我们未在阿德福韦酯耐药联合恩替卡韦治疗的患者中发现更广泛的耐药位点，是否与观察时间不是足够长（仅48周）有关，有待在以后的工作中进一步观察。

[1]乙型肝炎病毒耐药专家委员会.乙型肝炎病毒耐药专家共识.中华实验和临床感染病杂志（电子版），2008，2：90-98.

[2]乙型肝炎病毒耐药专家委员会.乙型肝炎病毒耐药专家共识：2009年更新.中华实验和临床感染病杂志（电子版），2009，3：72-79.

[3]中华医学会肝病学分会和感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.实用肝脏病杂志，2011，14（2）：81-89.

[4]Liaw YF，Kao JH，Piratvisuth T，et al.Asian-Pacific consensus statement on the management of chronic hepatitis B:a 2012 update.Hepatol Int，2012，6:531-561.

[5]European Association For The Study Of The Liver.EASL clinical practice guidelines:management of chronic hepatitis B virus infection.J Hepatol，2012，57:167-185.

[6]参加乙型肝炎病毒讨论会专家.核苷和核苷酸类药物治疗慢性乙型肝炎的耐药及其管理.中华肝脏病杂志，2013，21：15-21.

[7]姚光弼，崔振宇，姚集鲁，等.国产拉米夫定治疗2200例慢性乙型肝炎的Ⅳ期临床试验.中华肝脏病杂志，2003，11：103-108.

[8]姚光弼，王宝恩，崔振宇，等.拉米夫定治疗慢性乙型肝炎三年疗效观察.中华内科杂志，2003，42：382-387.

[9]Yao GB，Zhu M，Cui ZY，et al.A 7-year study of lamivudine therapy for hepatitis B virus e antigen-positive chronic hepatitis B patients in China.J Dig Dis，2009，10:131-137.

[10]Delney IV WE，Yang H，Westlane CE，et al.The hepatitis B virus polymerase mutation rtV173L is selected during lamivudine therapy and enhances viral replication in vitro.J Virol，2003，77:11833-11841.

[11]Orlando R，Tosone G，Portella G，et al.Prolonged persistence of lamivudine-resistantmutantandemergenceofnewlamivudine-resistant mutants two years after lamivudine withdrawal in HBsAg-positive chronic hepatitis patients:a case report.Infection，2008，36:472-474.

[12]Yeh CT，Chien RN，Chu CM，et al.Clearance of the original hepatitis B virus YMDD-motifmutants with emergence of distinct lamivudine-resistant during prolonged lamivudine therapy. Hepatology，2000，31:1318-1326.

[13]Tenney DJ，Levine SM，Rose RE，et al.Clinical emergence of enticavir-resistant hepatitis-B virus requires additional substitutions invirusalreadyresistanttolamivudine.AntimicrobAgents Chemother，2004，48:3498-3507.

[14]Sherman M，Yurdaydin C，Simsek H，et al.Entecavir therapy for lamivudine-refractorychronichepatitisBimprovedvirologic，biochemical，and serology outcomes through 96 weeks.Hepatology，2008，48:99-108.

[15]吴珍萍，韩涛，高英堂，等.拉米夫定耐药后阿德福韦酯治疗应答欠佳患者乙型肝炎病毒耐药变异模式.中华肝脏病杂志，2010，18：498-501.

[16]刘峰，王磊，王丽娜，等.阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎过程中发生病毒学突破患者的（HBV）P基因变异分析.山东大学学报（医学版），2008,46：407-410.

[17]Villet S，Pichoud C，Billioud G，et al.Impact of hepatitis B virus rtA181V/T mutants on hepatitis B treatment failure.J Hepatol，2008，48:747-755.

[19]Gerolami R，Bourliere M，Colson P，et al.Unusual selection of rtA181V HBV mutants cross-resistant to adefovir following prolonged lamivudine monotherapy:report of two cases.Antivir Ther，2006，11:1103-1106.

[20]European Association For the Study of the Liver.EASL clinical practice guidelines:management of chronic hepatitis B.J Hepatol，2009，50:227-242.

[21]Cho HC，Kim YJ，Gwar GY，et al.One–year study of entecavir and adefovir combination therapy for rtA181V/T mutants in priorlamivudine-resistanthepatitisBvirus.Hepatology，2011，54（Suppl）:1065A-1066A.

（收稿：2013-11-18）

（校对：陈从新）

Rescued antivira ltherapy of patients with hepatitis B virus rtM204/rtA181 mutants resistant to lamivudine or adefovir

JiaDexing，FengJing，LiPing，etal.DepartmentofInfectiousDiseases，People’s Hospital，Weifang 261041，Shandong Province，China

ObjectiveTo evaluate hepatitis B virus（HBV）mutations and its impact on antiviral effects in chronic hepatitis B（CHB）patients with mutants resistant to lamivudine or adefovir.Methods142 nucleos（t）idenaive CHB patients treated with lamivudine were switched to lamivudine plus adefovir（n=72）or entecavir plus adefovir（n=70）because of lamivudine resistance and 72 nucleos（t）ide-naive CHB patients treated with adefovir were switched to adefovir plus lamivudine（n=36）or adefovir plus entecavir（n=36）after resistance occurred. HBV DNA polymerase reverse transcriptase mutations were analyzed before and after 48 weeks of rescue therapy. ResultsAmong CHB patients with lamivudine resistance，mutation patterns were mainly M204V and IL180M，with a frequency of 98.6%（140/142）and 56.3%（80/142），respectively；Undetectable serum HBV DNA were noted in 86.1%of patients in lamivudine and adefovir treatment group，and 97.1%of patients in entecavir and adefovir treatment group（P＞0.05）；Among CHB patients with adefovir resistance，A181V and N236T mutation rates were 63.9%（46/72）and 52.8%（38/72），respectively；Undetectable serum HBV DNA were found in 52.8%（19/36）of patients in adefovir and lamivudine treatment group，significantly lower than that[77.8%（28/36），x2＝4.963，P＜0.05]of patients in adefovir and entecavir treatment group.ConclusionsAddition of adefovir dipivoxil to lamivudine is effective rescue therapy in patients with rtM204 mutation resistance to lamivudine，but in patients with rtA181 mutation resistance to adefovir dipivoxil，the addition of entecavir is superior to lamivudine.

Hepatitis B；Lamivudine；Adefovir；Drug resistance；Rescue therapy

261041山东省潍坊市人民医院感染性疾病科

贾德兴，男，52岁，主任医师。主要从事感染性疾病诊断与治疗学研究。E-mail:jiadexing@medmail.com.cn

冯静，E-mail:fengjing201001@aliyun.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.013